| 研究課題/領域番号 |
18K05398
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| 研究機関 | 東京農業大学 |
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研究代表者 |
矢嶋 俊介 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (90301548)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | X線結晶構造解析 / 基質認識 |
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| 研究実績の概要 |
ABCトランスポーターは細菌からヒトに至るまですべての生物において存在し、糖、アミノ酸、微量化合物などの細胞への出入りという基本的な生理機能を担う重要な役割を果たしている。今回、Microbacterium hydrocarbonoxydansのヒドラジド分解を担うオペロン中に、ジペプチドトランスポーターとアノテーションされる蛋白質と、新たな構造を有する可能性をもつABCトランスポーターの2種類の遺伝子が並んでいることを見いだした。また、このタンデムに存在するトランスポーターは放線菌門に広く存在することが示唆された。そこで本研究では、２種のトランスポーターの立体構造、機能解析を中心に、この新規オペロン構造の生理機能上の重要性解明を目的として研究を進めている。
今年度は特にX戦結晶構造解析により、トランスポーターの構造解析を目指した。その中で特に、細胞外の基質認識に重要なsubstrate binding subunit (SBS)の構造解析を試みた。SBSはジペプチドトランスポーターのSBSとアノテーションされるが、得られたX線回折データを分子置換法により解を得ることができなかった。そのため、セレノメチオニン置換蛋白質を作成し、結晶化Se-SAD法により初期位相、構造を得た。得られた全体構造は、既知のジペプチドトランスポーターと同様の形を取っていた。一方で、基質が結合すると考えられるキャビティは、ジペプチドトランスポーターSBSと比較し、疎水性度が高い環境であった。これは、本SBSの基質であるHBPHが疎水性度の高い化合物であることに適していると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目的は、Microbacterium hydrocarbonoxydans由来ABCトランスポーターの機能解析である。そのアプローチとしてトランスポーターの構造解析と遺伝子破壊による機能解析を目指している。今年度は特にX戦結晶構造解析により、トランスポーターの構造解析を目指した。その中で特に、細胞外の基質認識に重要なsubstrate binding subunit (SBS)の構造解析を試みた。SBSはジペプチドトランスポーターのSBSとアノテーションされるが、得られたX線回折データを分子置換法により解を得ることができなかった。そのため、セレノメチオニン置換蛋白質を作成し、結晶化Se-SAD法により初期位相、構造を得た。得られた全体構造は、既知のジペプチドトランスポーターと同様の形を取っていた。一方で、基質が結合すると考えられるキャビティは、ジペプチドトランスポーターSBSと比較し、疎水性度が高い環境であった。これは、本SBSの基質であるHBPHが疎水性度の高い化合物であることに適していると考えられた。
また、トランスポーターの本体である膜貫通サブユニットについては、蛋白質の発現系の構築を試み、大腸菌での発現に成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究は、当初の計画に従い、本研究の目的であるABCトランスポーターの機能解析を引き続き進めていく。トランスポーターのX線結晶構造解析では、基質認識を行うSBSと基質との複合体構造の取得を目指す。膜貫通サブユニットについては、結晶化の試みを行っていく。さらに、機能解析における遺伝子破壊実験では、当該のMicrobacterium 株の形質転換系の構築が重要であることから、まず適切なプロモーター、マーカー遺伝子の探索、形質転換法の確立を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
計画的に研究を進めたが、試薬などの価格の変動や、手法の改良などにより、予定よりも使用額に余裕を生じた。この金額は、次年度に用いることでより多くの条件検討などに効率的に使用する予定である。
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