| 研究課題/領域番号 |
18K05402
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| 研究機関 | 崇城大学 |
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研究代表者 |
笹野 佑 崇城大学, 生物生命学部, 准教授 (90640194)
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| 研究分担者 |
田口 久貴 崇城大学, 生物生命学部, 教授 (90212018)
原島 俊 崇城大学, 生物生命学部, 教授 (70116086)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ゲノム工学 / CRISPR/Cas9 / 染色体工学 / 酵母 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、出芽酵母を用いて、複数個所の遺伝子領域を重複ないし欠失させることで、染色体の異数性を大規模かつランダムに引き起こし、従来技術では得ら
れない多様なゲノム組成を持つ菌株集団を作製し、これを最終的に菌株育種へと応用することを目指すものである。
欠失による異数体作製については、昨年度、酵母染色体の末端領域計17領域をターゲットに、少なくとも2か所が欠失した菌株ライブラリーを作製した。これを用いて、発酵阻害物質であるフルフラールやHMFなどのフラン化合物含有培地での生育及び発酵生産性が向上した菌株を取得した。今年度は、より重要な遺伝子が多く含まれる内部領域26領域をターゲットに少なくとも2領域が同時に欠失したライブラリーの作製を行った。高温耐性等のストレス耐性株のスクリーニングまでには至らなかったが今後行っていく。また、昨年度までの結果を、実用バイオエタノール生産株に応用し、２つの染色体末端領域が欠失した菌株を作製した。それらの株は実験室酵母株と同様に、フラン化合物の分解速度が速くなり、結果的にこれら阻害物質存在下での発酵生産性が向上することを示した。
重複による異数体作製については、以前の申請者らの予備実験では少なくとも2か所の遺伝子領域の同時重複に成功していたが、今回、1か所の遺伝子領域の重複は成功するものの、2か所の遺伝子領域の同時重複を行うことが出来なかった。従って、複数領域が同時に重複した異数体ライブラリーは未だ作成できていない状況である。急遽、同時並行的に、二倍体酵母株を親株として、相同染色体の片方の遺伝子領域を欠失することで部分異数体を作製する試みも行っているが、まだ結果は得られていない
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
複数染色体領域の同時欠失については、当初の予定通り内部領域を対象とした菌株ライブラリーの作製に成功した。ストレス耐性株のスクリーニングまでは至らなかったものの、次年度に行う予定である。
複数染色体領域の同時重複については、技術的にも欠失よりも難しいこともあり、また担当学生の能力意欲不足等もありほとんど進展は見られなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
複数染色体領域の同時欠失については、内部領域の欠失ライブラリーから高温耐性、フラン化合物耐性等の有用株をスクリーニングする。さらに、末端染色体領域においても行ったように、実用バイオエタノール生産株において内部染色体領域の欠失株を作製し、ストレス環境下での発酵生産性を評価する。
複数染色体領域の同時重複については、まずはライブラリーを作成したい。当初の予定ではCRISPR-PCDup法を用いた線状染色体として重複する方法を考えていたが、今までの試みではなかなか成功しないため、環状染色体として重複する、あるいは全く新しいアプローチとして染色体外環状染色体（EccDNA）として重複するということも考えている。予備的な実験ではポジティブな結果も得られている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究において、物品費の多くはPCR用のオリゴヌクレオチドプライマーが占める。欠失ライブラリーを作成するためにある程度購入したが、重複ライブラリーの作製にはまだ至っておらず、この分の物品費が今年度では使用できなかったため。
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