| 研究課題/領域番号 |
18K05403
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
稲岡 隆史 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品研究部門, 上級研究員 (40391205)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | NADPH / グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ / ペントースリン酸経路 / TCA回路 / NTD |
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| 研究実績の概要 |
NADPHの合成はペントースリン酸経路とTCA回路で合成される。グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ(Zwf)はペントースリン酸経路の最初の酵素であり、Zwfを欠損した株ではペントースリン酸経路でのNADPH合成ができないため、Zwf欠損株のNADPH合成はTCA回路に依存する。そのためZwf欠損株が増殖できない培養条件ではTCA回路が不活性化され、NADPH合成ができないものと考えられる。予備的実験において、Zwf株が増殖できない培養条件下において、glcP遺伝子破壊によっておこるネオトレハロサジアミン（NTD）過剰生産がZwf欠損株の増殖能を回復することがわかっている。そこで、IPTG添加により誘導可能なプロモーターの制御下でglcP遺伝子の発現を調節し、Zwf欠損株の増殖回復に必要なNTD合成遺伝子（ntdABC）の発現量を調べたところ、ntdABCの発現レベルが約３０倍以上の時、Zwf欠損株の増殖が回復することがわかった。また、細胞内のNADPH測定のため、菌体試料の調整法や測定法などを検討し、予備的に測定した結果、細胞内NADPH量はZwf株で野生株の約５～１０％程度であったのに対し、glcP遺伝子を破壊することにより約５０％程度まで回復することが示唆された。これはNTDの過剰生産がTCA回路を活性化し、NADPHが合成されたことを裏付けるものである。引き続きNADPHの定量を行うとともに、他のTCA回路の酵素活性なども測定し、NTD合成とエネルギー代謝との関連性を調査する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
NADPHの定量は本研究課題の核となる部分である。NADPHは不安定なため、定量が困難であり、測定法の確立に時間を要することも予想されたが、試料の調整法や測定キットを検討した結果、予備的実験で細胞内NADPH定量の見込みを立てることができた。また、NTD合成遺伝子の発現量とZwf株の増殖能との関係を明らかにすることができ、順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
①NTDおよびカノサミンの生理活性比較
他の研究グループにより、NTD生合成オペロンにはカノサミン合成に必要な酵素がコードされているが、カノサミン2分子を結合する最終反応を触媒する酵素は含まれていないことが報告された。そこで、細胞内ではNTDではなく、カノサミンとして生理機能を発揮している可能性も考えられるため、カノサミンがオートインデューサーとして機能するかどうかを検証する。
②NADPH定量
NADPHの定量は本研究課題の核となる部分である。H30年度内にNADPH測定の目途が立ったため、H31年度には各変異株や培養条件による細胞内NADPH量の測定を行う。
③TCA回路の各酵素活性測定
TCA回路の各酵素活性を測定できるキットは各種販売されているため、これらキットを利用してZwf株やCodY破壊株、NTD過剰生産株におけるTCA回路の酵素活性を測定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初、NADPH定量や酵素活性測定用の試薬購入費として予算を計上したが、本研究課題で最も重要となるNADPH測定法の確立を最優先にしたため、他の酵素活性の測定を行うまでには至らなかった。NADPH測定に目途が立ったことから、次年度以降、NADPHの定量の他、TCA回路の酵素活性測定などを順次行っていく予定である。
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