| 研究課題/領域番号 |
18K05407
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| 研究機関 | 埼玉大学 |
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研究代表者 |
仲本 準 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (30192678)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 分子シャペロン / ClpB / DnaK / DnaJ / シアノバクテリア / シャペロンネットワーク |
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| 研究実績の概要 |
Synechococcus elongatus PCC7942には、ClpBは2種類、DnaKは3種類、DnaJを含むJタンパク質は10種類が存在する。本研究では、これらのパラログに注目し、シアノバクテリアで独自に進化した、増殖・生存に必須の新規ClpB/DnaKシャペロン系を解明することを目的とする。我々は、DnaK2はDnaJ2及びGrpEとシャペロン系（K2システム）を形成し、変性タンパク質の再折りたたみを促進することを報告した。さらに、ClpB1が、K2システムと共同でタンパク質の凝集体を可溶化することを明らかにしたが、ClpB2には凝集体可溶化活性は検出されなかった。大腸菌ClpBやClpB1、酵母のClpBホモログ（Hsp104）とは異なり、ClpB2は致死的な高温に対する（細胞の）耐性獲得には必要とされないと報告されているが、これとClpB2に凝集体可溶化機能が無いこととは矛盾しない。我々は、ClpB2が非天然構造のタンパク質と相互作用し、その凝集を阻止する活性をもつことを明らかにしたが、K2システムを共存させると、この変性タンパク質は再生した。これは、非天然構造のタンパク質（基質）が、ClpB2を介してK2システムに受け渡されて折りたたむことを示唆するもので、新規で重要な発見である。STRINGによるタンパク質間相互作用解析により、ClpB2は、必須のDnaK3やDnaJ1と相互作用すると予測された。そこで、K2システムにおいて、DnaK2をDnaK3に、DnaJ2をDnaJ1に変えてシャペロン系の構築を試みた。現在までのところ、DnaK3では折りたたみ活性を検出することはできていないが、DnaJ2とDnaJ1を入れ替えたDnaK2/DnaJ1/GrpEシャペロン系においては、変性タンパク質の再折りたたみ速度や収率が増えた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
In silicoの解析により、ClpB2は、必須のタンパク質であるDnaK3あるいはDnaJ1と相互作用すると予測された。これは、ClpB2が、DnaK3やDnaJ1と新規なシャペロン系を形成することを示唆するものである。そこでまず、DnaK3シャペロン系あるいはDnaJ1を含むシャペロン系の確立を目指した。DnaK3にDnaJ2とGrpEを加えても、変性（非天然構造の）タンパク質の再折りたたみ反応は全く検出されなかったが、DnaJ2の代わりにDnaJ1を加えたDnaK2/DnaJ1/GrpEにおいては、DnaJ2よりも速やかにかつ高収率で再折りたたみ反応が起こった。DnaJ1とDnaJ2は共にDnaKと相互作用するJドメインをもっているが、本結果は、Jドメイン以外の領域・ドメインが、DnaK2のシャペロン機能の調節において、重要なはたらきをすることを示唆するものである。ClpB2は、DnaJ1やDnaJ2のJドメイン以外の領域・ドメインと相互作用すると予測される。我々は既に（ClpB1とは異なり）ClpB2はDnaK2と相互作用しないことを示唆する結果を得ている。ClpB2はDnaJ1を介してDnaK2と相互作用するのかもしれない。上記のように、当該年度の研究により、ClpB2とDnaJ1の相互作用解析を行う準備が整ったので、本研究課題はおおむね順調に進んでいると評価した。もし、DnaJ1存在下では、ClpB2とDnaK2の協調的なシャペロン作用が（DnaJ2存在下よりも）顕著に起こる（タンパク質の折りたたみ速度と折りたたみ収率が増大する）ならば、ClpB2とDnaK2/DnaJ1/GrpEのシャペロン系が、細胞の増殖・生存にとって必須のはたらきをしていることが強く示唆される。
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| 今後の研究の推進方策 |
ClpB2とDnaK2/DnaJ1/GrpEの協調的シャペロン作用を解析する。具体的には、リンゴ酸脱水素酵素やグルコース-6-リン酸脱水素酵素などのモデル変性タンパク質基質（S）とClpB2の複合体を形成させ、この複合体におけるSの、DnaK2/DnaJ1/GrpEによる再活性化を、DnaK2/DnaJ2/GrpEのそれと比較する。また、ClpB（あるいは酵母のホモログHsp104）とDnaJ（あるいは酵母のホモログHsp40）が物理的に相互作用するという報告は（筆者が知る限り）無いので、ClpB2とDnaJ1との相互作用を、免疫沈降法やプルダウン法、酵母ツーハイブリッド法等により解析する。
DnaK3は、DnaJ2やGrpE存在下で全く「折りたたみ活性」を示さなかったが、その精製方法や折りたたみ反応液の組成・条件等を検討する。折りたたみ活性が検出された場合には、ClpB2との協調的シャペロン作用を解析する。
STRINGによるタンパク質間相互作用解析（https://string-db.org/network/1140.Synpcc7942_0637）で、ClpB2は、HtpG（Hsp90）、GroEL1、 GroEL2等の分子シャペロンと相互作用すると予測された。そこで、これらのシャペロンとの物理的相互作用や協調的シャペロン作用の解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
分子シャペロンの基質としてルシフェラーゼを用いた分子シャペロン活性測定法の確立が遅れ、この酵素の活性を測定するために購入を予定していたルミノメーターの購入を見送った。そのために支出が減り、次年度使用額が生じた。
ルシフェラーゼを用いた分子シャペロン活性測定法を確立し、その方法を用いることが必須である場合には、翌年度にルミノメーターを購入する。そうでない場合には、経年劣化している機器・器具の修理・補填や、学術雑誌への論文投稿費用や国内外における会議での成果発表用旅費等に用いる予定である。
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