| 研究課題/領域番号 |
18K05408
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
水口 千穂 (鈴木千穂) 東京大学, 生物生産工学研究センター, 助教 (10733032)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 核様体タンパク質 / 翻訳後修飾 / アセチル化 / プラスミド / Pseudomonas |
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| 研究実績の概要 |
本年度はPseudomonas putida KT2440株の染色体にコードされるMvaTホモログTurA、TurB、及びプラスミドpCAR1にコードされるPmrについて、各タンパク質を特異的に認識する抗体を用いて免疫沈降を行い、以前、全タンパク質を用いてアセチローム解析を行った時よりも多くアセチル化部位の検出ができないか試みた。免疫沈降後のサンプルは、いずれもSDS-PAGEでほぼ単一のバンドになっていたが、実際にLC-MS/MS解析を行うと多くの夾雑タンパク質が検出された。このためTurAについてSDS-PAGEのバンドを切り出して再度LC-MS/MS解析に供した結果、以前は2箇所のアセチル化部位が検出されていたのに対し、今回は6箇所検出することに成功した。このうち3箇所はMvaTホモログの二量体／多量体化ドメイン内に存在していた。そこで当該ドメインの機能解析の一環として、このドメイン内に存在する二箇所の二量体化部位のうち、terminal dimerization siteの結晶構造を取得した。現在精密化を進めている段階ではあるが、以前の報告 [Suzuki-Minakuchi et al., FEBS Lett., 590:3583-94, 2016] と矛盾する結果が得られているため、今後は溶液中の構造の取得も目指す。また並行して、当該領域におけるTurA、TurB、Pmr間の親和性の評価も進めている。
本研究ではMvaTホモログ以外の核様体タンパク質としてNdpAホモログも対象としている。このタンパク質についてはドメイン構造に関する情報が無かったため、本年度はタンパク質を切り縮めた派生体を作製し多量体形成能を評価した。現在実験を進めている段階ではあるが、少なくともC末端側に二量体化を担う部位が存在することが示唆されている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本年度は当初予定していたMvaTホモログのアセチル化部位の同定に加え、MvaTホモログとNdpAホモログの機能解析で一定の成果が得られたため、当初の計画以上に進展していると判断した。また、同定されたアセチル化部位のうち、二量体／多量体化ドメイン内に存在している3箇所については、既にアルギニンへの置換（脱アセチル化状態を模したもの）及びグルタミンへの置換（アセチル化状態を模したもの）を行った発現用プラスミドの作製まで完了している。このため、次年度はアセチル化残基がMvaTホモログの機能に及ぼす影響を評価できると期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
MvaTホモログのアセチル化部位の同定については次年度中の完了を目指す。また、脱アセチル化状態・アセチル化状態を模したタンパク質派生体の作製と並行して、in vitroでのアセチル基の部位特異的導入を進める。本実験については今年度も進めていたが、アセチル基の導入効率が良くない傾向が見られるため、次年度中に改善が見られない場合は擬似アセチル化タンパク質を用いた実験に注力することとする。MvaTホモログの構造についてはX線溶液散乱測定を試みる（創薬等先端技術支援基盤プラットフォームを介して支援を依頼済み）。また、TurA、TurB、Pmr間の親和性の評価とNdpAホモログのドメイン情報の取得については本年度の実験を継続する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
学会参加が東京近郊開催のもの中心となり金額が少なくて済んだことと、LC-MS/MS解析費用として計上していた分が共同研究先のご厚意により不要となったため次年度使用額が生じた。次年度は擬似アセチル化置換株のトランスクリプトーム解析も進める予定であり、本実験を当初計画（次世代シーケンサー用消耗品を購入し自前で実施する）とは異なり外注したいと考えているため、次年度使用額はこの費用に当てたいと考えている。
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