2018 年度実施状況報告書

タンパク質アセチル化を含むバクテリアの新たなグルコース応答系の発見とその全貌解明

研究課題

研究課題/領域番号	18K05415
研究機関	東海大学
研究代表者	小倉光雄東海大学, 海洋研究所, 教授 (80204163)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2021-03-31
キーワード	RNA-seq / NAP / cis配列 / 非特異的DNA結合
研究実績の概要	sigXとsigM遺伝子のグルコース誘導(GI)が起きなくなるトランスポゾン挿入変異株を検索し,cshA, tsaD, ylxR, yqfOへの挿入変異株を得た。このうち、cshAはRNAヘリカーゼであり、かつRNAポリメラーゼに会合することが知られていた。すでにCshAタンパクのアセチル化がsigXのGIに重要であることは論文として報告した（Ogura and Asai, 2016）。これら遺伝子の間には何らかの連関が存在しうると考え、種々の試行錯誤を行なった結果、CshAがylxRを含むオペロンの転写を正に制御していること、YlxRはDNAに結合してtsaDを含むオペロンの転写を正に制御していることが判明した。tsaDを含むオペロンは５遺伝子からなり、最初の遺伝子はチミン生合成遺伝子thiLである。このオペロンに含まれるtsaEとtsaBは、翻訳後にTsaDと会合してTsaEBD複合体を作る。この複合体はtRNAのアンチコドンループの37位の修飾を行うことが知られている。thrC部位にPthiL-lacZ融合体を作成し、様々な欠失、点変異を導入し、ylxR遺伝子が野生型と破壊型の両方の菌株で発現解析を行った。その結果、YlxRの働気に必要なcis配列を特定したところ、それはアデニンに富む配列であり、DNA結合の特異性を維持するには十分ではないと考えられた。そこで、YlxRは単なる転写因子というよりも、染色体会合性のDNA結合性タンパク質である可能性を検討した。GFPと融合させたYlxRタンパク質の蛍光は、染色体を染めるDAPIの蛍光像と重なって観察されたので、おそらくこの予想は正しいものと思われる。さらにylxR破壊型と野生型の菌株の全遺伝子の転写産物量をRNA-seqにより比較解析したところ、YlxRは400近くの遺伝子を制御していることが判明した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由 YlxR解析については、順調に進展している。次年度はtsaD解析を本格的に実行しつつ、yqfOについても準備する予定である。
今後の研究の推進方策	tsaD遺伝子産物はtRNAのアンチコドンループの37位のアデニンを修飾する酵素のサブユニットであることがすでに知られている。大腸菌でtsaDがピルビン酸脱水素酵素複合体のアセンブリーに関わるという報告があり、この酵素はピルビン酸からアセチルCoAを生成する。すなわち、一つの可能性として枯草菌でもtsaDはこの酵素の翻訳や複合体形成に関係していて、細胞内のアセチルCoA生産を通じてCshAのアセチル化を制御しているという仮説が可能である。その証明が今後の課題である。具体的には、ピルビン酸脱水素をコードするpdhABCDの各遺伝子にHisタグをつけ、tsaD遺伝子が野生型と破壊型の２つの菌株を用いてwestern解析を行う。予備的にtsaD破壊株のグルコース添加条件での生育では、野生型に比してPdhABDタンパク質の量が顕著に低下していることを見出した。さらに、cell-free extractを細胞質タンパク画分、膜タンパク画分、凝集タンパク画分に分けた後でそれぞれの画分についてPdhAのwestern解析をおこなう予定である。
次年度使用額が生じた理由	計画実行のために必要な機器を購入する目的で、当初計画の１年目の配分額を変更した。その際、消耗品購入に備えて額を見積もったが、結果として購入した消耗品の金額が見積もりを下回ったため次年度使用額が発生した。