| 研究課題/領域番号 |
18K05417
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| 研究機関 | 東京農業大学 |
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研究代表者 |
朝井 計 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (70283934)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 遺伝子サイレンシング / DNAメチル化 |
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| 研究実績の概要 |
納豆菌の類縁菌で高い自然形質転換能をもつ枯草菌ゲノムに光合成細菌のシアノバクテリアゲノムを挿入した、キメラゲノム細菌シアノバチルスでは、興味深いことにシアノバクテリアゲノムが分断して組み込まれた３領域に特徴的に転写産物が検出されないことが、シアノバチルスの全転写産物のRNA-Sequencing解析により判明した。この現象を、水平伝播における外来遺伝子の発現を阻む機構を再現したものであり、実験室で解析することができる具体例と考え、その機構を、キメラゲノム細菌、シアノバチルスを使って分子レベルで詳細に解明することを目的として解析を行った。
成果１）シアノバチルスにおける、シアノバクテリア由来の遺伝子の発現がおきない原因の一つとして枯草菌由来の遺伝子発現システム、転写装置（RNAポリメラーゼホロ酵素[RNAP]）やリボソームを含む翻訳装置がシアノバクテリア遺伝子に適合していないことが考えられる。枯草菌内でシアノバクテリア由来のRNAPの各サブユニットについて改変を加え、RNAPコア酵素の構築に成功した。またシアノバクテリアのシグマFを枯草菌内で発現させ、枯草菌RNAPコア酵素とのホロ酵素を形成させ、転写活性を有することを確認した。SD配列の認識に関わるリボソーム中のS1リボソームタンパク質およびそれと密接に関わるS2、S3、S14タンパク質について、シアノバクテリア由来のこれらのタンパク質を枯草菌内で発現させる株を作製した。
成果２）シアノバチルスにおける、シアノバクテリア由来の遺伝子の発現がおきない原因の一つとしてDNAのメチル化や核様体タンパク質によるエピジェネティックな制御が考えられる。そこで、枯草菌内在性のDNAメチル化酵素に加えて、異種細菌の４つのDNAメチル化酵素を枯草菌内で発現させ、枯草菌ゲノムをメチル化していることを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は当初以下の２つの実験過程に分けて、枯草菌宿主細胞内におけるシアノバクテリア由来のDNAの遺伝子発現抑制、遺伝子サイレンシングについて解析することとした。１）シアノバクテリアの遺伝子発現に適した、転写装置、翻訳装置を宿主である枯草菌細胞の中で構築すること。２）核様体タンパク質やDNAメチル化によるエピジェネティックな遺伝子発現制御について解析すること。
１）に関しては、枯草菌内でシアノバクテリア由来のRNAPの各サブユニットについて改変を加え、RNAPコア酵素の構築に成功した。またシアノバクテリアのシグマFを枯草菌内で発現させ、枯草菌RNAPコア酵素とのホロ酵素を形成させ、転写活性を有することを確認した。また、翻訳開始に関与する複数のリボソームタンパク質S1およびS2、S3、S14タンパク質について、シアノバクテリア由来のこれらのタンパク質を枯草菌内で発現させる株を作製した。これらの改変によりシアノバクテリア由来の遺伝子が枯草菌内で発現するかどうかの検討が今後の課題であるが、そこに移行する準備は整っていると判断した。
２）に関しては、枯草菌+シアノバクテリアであるシアノバチルスにおいて、核様体タンパク質やDNAメチル化によるエピジェネティックな遺伝子発現制御について未解析である。しかしながら、その解析の助けとなる異種細菌の４つのDNAメチル化酵素を枯草菌内で発現させる株を構築し、枯草菌ゲノムをメチル化していることを確認した。また、核様体タンパク質についても、現在その発現株を作製中である。
以上のように当初予定した計画の準備段階のものもあれば、解析に移行できる状態になりつつある段階のものもあるため、区分は（２）とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）枯草菌内で構築できた、シアノバクテリア由来のRNAPコア酵素に加え、シアノバクテリア由来の主要シグマ因子シグマAも効率よく発現させ、シアノバクテリア由来のRNAPホロ酵素の構築を目指す。同様に枯草菌内で発現させることができた、シアノバクテリアのシグマFについても、シアノバクテリアRNAPコア酵素とホロ酵素を形成させる。それらのホロ酵素をシアノバチルス内で発現させ、シアノバクテリア由来の遺伝子の発現誘導を観察する。また、シアノバクテリア由来の翻訳開始に関与する複数のリボソームタンパク質S1およびS2、S3、S14タンパク質を枯草菌内で発現させたことにより、シアノバクテリア由来の遺伝子の発現が翻訳段階でも改善されたかどうかを検討する。
２）枯草菌+シアノバクテリアであるシアノバチルスについて直接、増殖の各段階におけるDNAメチル化状態を次世代シーケンサーにより検出し、エピジェネティックな遺伝子発現制御について解析する。加えて、枯草菌内在のDNAメチル化酵素に加えて、異種細菌の４つのDNAメチル化酵素を枯草菌内で発現させ、新たなDNAメチル化により枯草菌の遺伝子発現に変化を生じるかを解析する。また、核様体タンパク質については、枯草菌では現段階で一般的な核様体タンパク質として機能していると判明しているタンパク質がないため、大腸菌の核様体タンパク質を枯草菌内で発現させ、枯草菌遺伝子の発現に影響を及ぼすかを観察する予定である。
３）導入したシアノバクテリアゲノムが、巨大なため、発現誘導の影響が大き過ぎることも考えられる。そこで、枯草菌ゲノムに導入する異種細菌のゲノムとして、シアノバクテリアのゲノムとは別に、枯草菌に比較的近縁のゲノムサイズの小さい難培養性の腸内細菌であるセグメント細菌のゲノムを導入する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）最大の理由は、本事業内容に密接に関連した内容で先進ゲノム支援に応募し採択されたことである。その支援に必要な株の作製には現存の設備・試薬で賄うことが可能であった。一方で、本事業内容に基づき、研究計画を練り直す時間が必要であり、ウェットな解析以外に、資料やパソコンを利用したドライな解析を中心に研究をすすめた。そのための新たな材料の入手や打ち合わせに費用を使用した。また、交付申請書にも記載したように、当初から解析対象としている、枯草菌+シアノバクテリアであるシアノバチルスに加え、難培養性の腸内細菌であるセグメント細菌のゲノムを枯草菌に導入し、シアノバチルスと並行して、解析することを検討した。セグメント細菌のゲノムは枯草菌のゲノムと比較して極端にGC含量が低く、また難培養であるため良質のゲノムDNAが得られない。そのためにゲノムの導入には、新たな条件検討が必要であり、こちらも資料やパソコンを利用したドライな解析を中心に研究をすすめた。
（使用計画）前述のように、準備段階は完了したので、当初計画に立ち戻り、シアノバチルスの株作製および、遺伝子発現解析などを実施する予定である。加えて、枯草菌+セグメント細菌の菌株の作製を積極的に行い、完了すればシアノバチルスでの解析と同様の解析を行う。
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