| 研究課題/領域番号 |
18K05417
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| 研究機関 | 東京農業大学 |
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研究代表者 |
朝井 計 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (70283934)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 遺伝子サイレンシング / DNAメチル化 / エピジェネティクス / 水平伝搬 |
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| 研究実績の概要 |
１）枯草菌＋シアノバクテリア＝シアノバチルスのゲノムにシアノバクテリア由来のRNAポリメラーゼ複合体中のSigFσ因子を強制的に発現させた。RNAポリメラーゼの発現をウエスタン法で確認し、枯草菌RNAポリメラーゼとの複合体形成を確認した。導入したSigFシグマ因子の機能発現を確認するために、シアノバチルスゲノム遺伝子の転写プロファイルの変化をRNA-sequencingにより解析した結果、SigF依存の転写が知られているシアノバクテリア由来の遺伝子の転写誘導が確認された。形質転換能が低下しているシアノバチルスに対して、接合伝達によるDNA導入を試みたが、観察されなかった。シアノバクテリアを部分的にゲノムに組み込んだ枯草菌株では、接合伝達現象が観察された。
２）枯草菌に近縁の難培養性の腸内細菌のゲノムの大規模導入を推し進めた。腸内免疫の賦活化に関わる腸内細菌の運動性に関わる遺伝子を含む50kbpのDNA領域とその遺伝子群に転写に関与すると考えられるσ因子を導入し、発現解析を行ったが観察されなかった。導入した腸内細菌の胞子形成開始遺伝群による胞子形成の誘発に成功した。
３）枯草菌内に大腸菌の核様体タンパク質H-NSとstpAを発現誘導した株について、解析した。枯草菌に感染するSPβファージが宿主の枯草菌でH-NSやStpAを発現することによって感染力が落ちたが、溶源化ファージを誘発するマイトマイシンCに対しては抵抗性の変化は見られなかった。前項２）の腸内細菌ゲノムを導入した株において、枯草菌の核様体タンパク質Rokを破壊すると、最少培地での増殖及び胞子形成に影響がみられた。このうち胞子形成に関しては、H-NSの発現により回復傾向がみられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は緊急事態宣言等の強い制限はかからなかったものの、都内の感染者数は高止まり、4月からまん延防止重点措置や緊急事態措置等で一部制約はあった。しかしながら、時間制限等、研究室、実験室への立ち入りに関しては、比較的通常の実験環境に復帰できたため、予定した実験計画について、ある程度の成果、進展は見られたため、「（３）やや遅れている」ではなく、「（２）おおむね順調に進展している」という区分とした。本年度は３つの実験過程に分けて、実験を計画した。１）枯草菌＋シアノバクテリア＝シアノバチルスのゲノム改変を目指し、接合伝達によるDNA導入を試みた。シアノバチルスは枯草菌由来であり、枯草菌同士ではみられる接合現象は容易に観察されると考えられたが、予想に反してその効率は著しく低かった。このことがその後のシアノバチルス解析の進展を遅らせる要因であった。２）枯草菌に近縁の難培養腸内細菌のゲノムを大規模に導入していく過程において、腸内細菌ゲノムの極端に低いGC含量が、PCRによる遺伝子増幅や大腸菌を用いたクローニングの効率低下に大きく響いた。３）細菌でのエピジェネティックな遺伝子発現を観察するために、枯草菌内の核様体タンパク質Rokの破壊や外来の核様体タンパク質の遺伝子を導入し、人工的に過剰発現させ、宿主の表現型の変化を観察した。枯草菌ファージを用いた解析では、それらの核様体タンパク質の顕著な影響が観察されなかったため、方針を転換し前項２）で導入中の外来DNAが宿主に与える影響に着目点を切り替え解析を始めたため、若干の遅れは生じたが、新たな展開を見せ始めている。
その結果、遺伝子発現の変化に起因すると考えられる細胞の表現型の変化が、どちらの実験例においても観察された。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）枯草菌＋シアノバクテリア＝シアノバチルスのゲノムにシアノバクテリアSigFσ因子を強制発現導入した株について、シアノバチルスゲノム遺伝子の転写プロファイルの変化をRNA-sequencingによってより詳細に解析する。具体的には培地（栄養豊富な培地、胞子形成培地等）の違いや、増殖相の違いが、影響するかを観察する。枯草菌からシアノバチルスへ接合伝達によるDNA導入の効率化を目指し、接合中の２つの細胞の培養条件を見直す。シアノバクテリアゲノムのどの部分が枯草菌の接合能を減少させたのかを解明する。シアノバクテリアの遺伝子操作が可能になれば、シアノバクテリアのプラスミドを枯草菌ゲノムに導入し、シアノバクテリアの未知の複製機構を枯草菌で再構成する。
２）枯草菌に近縁の難培養性の腸内細菌のゲノムの大規模導入を推し進める。運動性に関わる遺伝子クラスターを複数同時に枯草菌ゲノムに導入する。運動性遺伝子群の転写σ因子を強制的に発現させ、異種導入株の運動性の変化、相補性を確認する。腸内細菌の胞子形成は小ペプチドで誘発される可能性が示唆されたので、その因子の同定を試みる。
３）枯草菌のRok、外来の大腸菌H-NS・StpA等の核様体タンパク質の機能比較については、前項２）で導入中の外来DNAが宿主に与える影響に着目点を切り替え解析を進める。導入している外来腸内細菌のゲノムの塩基組成は宿主の枯草菌に比べ極端にGC含量が低い。そのようなゲノムを大規模に導入された場合の、宿主への影響解析は前人未踏の研究課題である。既に導入株の増殖や胞子形成分化能に、核様体タンパク質が影響を与えることがわかっているので、この現象について分子機構の解明を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）最大の理由は新型コロナウイルスによる社会活動への影響である。「現在までの進捗状況」にも記したが、本年度、感染者数は高止まりし、国内の制限はあったものの、比較的学内の制限は緩やかで、研究環境に大きな影響はなかった。しかし、それでも当初予定した実験計画通りには進展せず、研究の方向を微修正するために、要する費用に見直しが生じた。また、研究成果の報告、並びに情報収集のために、参加を予定していた多くの研究会・学会がオンライン開催となり、学会の現地参加のために計上していた交通費・宿泊費等の旅費が必要ではなくなった。
（使用計画）枯草菌+難培養腸内細菌の菌株の作製を大規模に行う。そのための、遺伝子増幅に使用するPCR用試薬、オリゴDNAの合成等の消耗品・試薬の購入が大幅に必要になる。導入したDNAの塩基配列の確認のためのDNA抽出キットやリシーケンスに必要な試薬・消耗品費、委託管理費に使用する。シアノバチルスの遺伝子発現解析、RNA-sequencing解析などを実施する予定である。そのためのRNA抽出キットや次世代シーケンスに必要な試薬・消耗品費、委託管理費に使用する。また最終的には、それらの解析結果の学会や研究会における発表と、論文作成を行う準備費用にあてる。
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