| 研究課題/領域番号 |
18K05421
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
松山 晃久 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 専任研究員 (90399444)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 翻訳制御 |
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| 研究実績の概要 |
真核生物に幅広く保存されている翻訳因子eIF5Aは、近年の研究により、翻訳の伸長反応において、連続したプロリンなど特定のアミノ酸配列を有するタンパク質の翻訳を促進すると考えられている。eIF5Aはその分子内にハイプシン化と呼ばれる特殊な翻訳後修飾を受けるタンパク質であり、ハイプシン化はeIF5Aの機能に必須である。ハイプシン化は二段階の反応により起こり、一段階目の反応でeIF5Aにデオキシハイプシンが付加され、その側鎖に水酸基が付加されて修飾が完結する。二段階目で付加される水酸基は高等生物では生育に必須であるが、酵母では水酸基の欠損は致死ではない。我々はこれまでに水酸基の欠損により翻訳に影響を受けるタンパク質を探索してきたが、そこで得られたタンパク質の多くは、これまで提唱されているようなeIF5Aを翻訳に必要とするアミノ酸配列を有していないことから、eIF5Aはハイプシン化修飾の状況に応じて異なるタンパク質を翻訳の標的としているのではないかという仮説に至った。そこで、初年度は、その仮説を検証するため、ハイプシン化に関わる酵素Dys1とMmd1を人為的にコントロール可能な株の作製を目指した。dys1は必須遺伝子であるため、近年開発されたAIDシステムを用いて条件特異的にノックダウンすることにした。この系は、植物ホルモンであるオーキシンを用いてAIDタグを有するタンパク質をユビキチン化し、即座に分解に導くというシステムである。しかし、分裂酵母での使用例は少ないことから、今後様々な遺伝子のノックダウンに使用できるように、より一般化した分裂酵母におけるAIDシステムを構築構築した。これにより、任意の遺伝子を標的としてノックダウンできる研究環境が整った。しかし、実際にdys1にAIDタグを付加し、ノックダウンを試みたが、オーキシン添加後も特に増殖に影響は出なかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
dys1は必須遺伝子であることから、dys1の条件特異的不活化を可能にすることは本研究において非常に重要である。AIDシステムを用いたタンパク質のノックダウンでは、インドール酢酸を用いてdys1の分解を誘導する条件下でも酵母の増殖には影響を及ぼさなかったことから、ノックダウンが予想通りに起こらなかった可能性が考えられる。ノックダウンが起こったかどうかは通常ウェスタンブロッティングにより確認できるが、Dys1の場合、タンパク質の発現量が低いため、そもそもウェスタンでは検出できなかった。しかし、もう一つの可能性として、Dys1がノックダウンされても細胞の生育に影響が出なかったことも考えられる。それは、すでにハイプシン化を受けたeIF5Aが細胞内には十分量存在するからである。今後はこのことも考慮に入れ、戦略を練る必要がある。
このように、dys1のノックダウン株の作製に時間がかかっているため、当初の研究予定からは遅れているが、AIDシステムは分裂酵母ではまだ一部でしか利用されていない技術であり、今後の研究のことを考えて、様々な遺伝子のノックダウンに使えるように新たにベクターを開発した。したがって、後半の研究ではよりスムーズな実験の進行が期待できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
前述したように、dys1をノックダウンできたとしても、細胞内に残っている成熟型eIF5Aの存在により、すぐには望みの表現型が現れない可能性が考えられる。そのため、今後は、すでに存在するeIF5Aを細胞から除去することも考慮に入れた方がよいと考えられる。eIF5AにもAIDタグを付加してノックダウンすると同時に、タグのないeIF5Aを発現誘導できるようにすれば、発現誘導により新たに合成されるeIF5Aはハイプシン化修飾を受けないため、未修飾の状態のeIF5Aだけが細胞内に存在することになると予想される。eIF5Aはゲノム内に２コピー存在するため、片方にはAIDタグを、もう一方には転写のオン・オフを制御可能なプロモーターを挿入することで、細胞内にハイプシン化されていないeIF5Aだけが発現している環境を作り出したい。同様のことはハイプシン化の二段階目の酵素Mmd1についても当てはまる。mmd1についてもdys1と同様にeIF5Aの発現を切り替え、ノックダウン後に合成されるeIF5Aがデオキシハイプシン化体のみになるようにしていきたい。目的の株作製後は、予定通りリボソームプロファイリングを用いて、ハイプシン化eIF5Aがない場合に翻訳に影響を受けるタンパク質のアミノ酸配列を解析していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度に行う予定だったリボソームプロファイリングの実験を次年度に行うことになったため、それに必要な次世代シークエンスのための費用を次年度に回した。
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