| 研究課題/領域番号 |
18K05421
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
松山 晃久 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 専任研究員 (90399444)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 翻訳 |
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| 研究実績の概要 |
近年の研究において、翻訳の伸長反応で特定のアミノ酸配列を有するタンパク質の翻訳を促進することが明らかになったeIF5Aは、その分子内に機能に必須なハイプシン化と呼ばれる特殊な翻訳後修飾を受ける。ハイプシン化は二段階の反応により起こるが、一段階目の反応でeIF5Aにデオキシハイプシンが付加され、その側鎖に水酸基が付加されて修飾が完結する。二段階目で付加される水酸基は高等生物では生育に必須であるが、酵母では水酸基の欠損は致死ではない。我々はこれまでに水酸基の欠損により翻訳に影響を受けるタンパク質を探索してきたが、そこで得られたタンパク質の多くは、これまで提唱されているようなeIF5Aを翻訳に必要とするアミノ酸配列を有していないことから、eIF5Aはハイプシン化修飾の状況に応じて異なるタンパク質を翻訳の標的としていることが予想された。
そこで初年度は、近年タンパク質の条件的ノックダウンが可能なAIDシステムを用いることによってハイプシン化に関わる酵素Dys1とMmd1を人為的にコントロール可能な株の作製を目指したが、試行錯誤の結果、この実験系ではノックダウンがうまく起こらないと結論付けられた。そのため、本年度は、dys1の温度感受性変異株とmmd1遺伝子破壊株を用いて、どのような配列においてリボソームが一時停止を起こしているかを調べるリボソームプロファイリングと、発現量を調べるRNA-seqの結果を統合するにより、ハイプシン化不全の株において、リボソームによる翻訳が特に影響を受ける配列を解析した。その結果、以前にmmd1遺伝子破壊株で特異的に発現量が低下するタンパク質の配列中に、ハイプシン化依存的にリボソームが停止する配列が見出された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本来はDys1をAIDシステムによりノックダウンすることで条件特異的にデオキシハイプシン化が起こらない状態を作り出すことを目指していたが、残念ながら、AIDシステムでは少なくともDys1のノックダウンはうまく起こらないことが判明し、予定通りには進んでいない。しかし、AIDシステムとは別に作製していたdys1の温度感受性変異株を用いたリボソームプロファイリングの解析から、過去にmmd1遺伝子破壊株を用いたスクリーニングで得られていたeIF5Aの翻訳標的と考えられるタンパク質の中に、リボソームが特異的に停止する配列をいくつか見出すことができたことから、本研究の遂行には必要なデータが得られた。
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| 今後の研究の推進方策 |
温度感受性変異株を用いたリボソームプロファイリング解析により、いくつかのタンパク質において翻訳にeIF5Aのハイプシン化が必要となる配列が見出されたことから、今後は、それらの配列が本当にリボソームの一時停止に関係するのかどうかを、部位特異的変異株を作製するなどして確認していく。さらに、候補となる配列の翻訳と、eIF5Aの修飾状態がどのような関係にあるのかを、ハイプシン化酵素の変異株における各タンパク質の翻訳レベルを調べることで明らかにしていく。
また、これまでに作製したものの期待通りのノックダウン結果が得られなかったAIDシステム用のタグ導入株については、近年開発された改変型オーキシンを用いるAIDノックダウン系について検討し、分裂酵母における改変型AIDシステムの適用性について調べていくと共に、リボソームプロファイリング解析への展開も視野に入れていきたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究計画ではいくつかのeIF5A関連の変異株を作製し、それらを用いたリボソームプロファイリング解析を行う際の次世代シークエンス、およびRNA-seq解析の費用を計上していたが、AIDシステムによるノックダウンがうまく機能しなかったため、その費用分を次年度に回すことにした。
次年度では、AIDシステムとは異なる方法によりeIF5Aの修飾が起こらない変異株を作製し、リボソームプロファイリング解析等を行うことにする。
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