| 研究課題/領域番号 |
18K05423
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| 研究機関 | 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 |
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研究代表者 |
佐藤 勝也 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 放射線生物応用研究部, 上席研究員(定常) (90370402)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 放射線抵抗性細菌 / デイノコッカス・ラジオデュランス / DNA損傷応答機構 / DNA修復機構 / PprIタンパク質 / 放射線乾燥応答モチーフ / DdrOタンパク質 / DdrAタンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオデュランスの高いDNA修復能を担うDNA損傷応答機構において、PprIタンパク質の機能に必須な部位を明らかにするために、変異型pprI遺伝子発現プラスミドを作製し、プラスミド相補試験を行った。具体的には、野生型pprI遺伝子発現プラスミドをテンプレートとして、Error-prone PCR法及び部位特異的変異導入法によって、pprI遺伝子領域内に1箇所アミノ酸置換となるように変異を導入した。これにより、得られた15種の変異型pprI遺伝子発現プラスミドを、PprI欠失変異株に導入し、PprI相補株とした。PprIタンパク質は、異なる3つの機能ドメインを有しており、導入した各変異部位は、主要な3つのドメインに含まれていない部位であるS12T、メタロプロテアーゼドメイン内のA64T、E97Q、E119Q、E149Q、DNA結合ドメイン内のR172C、A184S、Y196S、及びGAF様結合ドメイン内のT236S、V237A、H260L、P261S、S276N、R181A、D291Nである。紫外線に対する相補試験を行ったところ、E119Qを含むE149Q相補株は、PprI欠失変異株と同程度に高感受性であり、DNA損傷応答機構に重要な部位であることが示された。プラスミド相補試験によるPprIの機能に関わるアミノ酸部位について重要な知見を得ることができた。さらに、同定したPprIタンパク質の部位がどのような役割を担っているのかを明らかにするため、ddrA遺伝子のRDRモチーフを含むプロモーター配列の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を配置しルシフェラーゼ遺伝子の発現活性を指標としたレポーター株を作製した。紫外線に対して、野生型pprI遺伝子発現プラスミドを含むレポーター株のルシフェラーゼ遺伝子の発現活性の変動を確認でき、レポーターアッセイによるPprIタンパク質の機能解析を行う実験系を構築することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画通り、放射線抵抗性細菌のDNA損傷応答誘導因子PprIの機能解析について、デイノコッカス・ラジオデュランスの変異型pprI遺伝子発現プラスミドの作製し、ガンマ線、紫外線及びマイトマイシンCに対する生存率を指標としたプラスミド相補試験によるPprIの機能解析を実施しており、おおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
作製した変異型pprI遺伝子ライブラリーを用いて、DNA損傷応答機構のリプレッサータンパク質であるDdrOとの相互作用、さらにDNA損傷応答機構のレギュロンであるPprA及びRecAタンパク質の発現誘導に与える影響について解析することで、DNA損傷応答機構においてPprIタンパク質の機能に重要な部位を明らかにし、デイノコッカス・ラジオデュランスのDNA損傷応答機構の全容解明に向けた研究を推進する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
調達方法の工夫により、経費が節約できたため。
差額に関しては、次年度の交付金と合わせ実験に必要な消耗品の購入に充当したい。
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