2018 年度実施状況報告書

N結合型糖鎖の生合成過程をレポーターとした細胞の健康状態の定量化に関する研究

研究課題

研究課題/領域番号	18K05427
研究機関	札幌医科大学
研究代表者	藤谷直樹札幌医科大学, 医学部, 助教 (10374191)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2021-03-31
キーワード	N結合型糖鎖 / ERストレス / 質量分析
研究実績の概要	生合成される半数以上のタンパク質は小胞体（ER）においてN結合型糖鎖修飾を受けることから、N結合型糖鎖の生合成過程を定量的に解析することは、様々な疾患の原因の1つであるERストレスを定量的に表現することを可能にする。総合的にN結合型糖鎖修飾にまつわる糖鎖群の定量的な構造解析のため、本年度は、タンパク質上のN結合型糖鎖、その生合成過程における分解物である遊離糖、さらには前駆体であるドリコール二リン酸結合型糖鎖の3種の構造解析方法の確立をHeLa細胞をモデルとして、質量分析法を用いて行った。特に本年度は、極めて微量であるがゆえに解析が比較的難しいとされるドリコール二リン酸結合型糖鎖の捕捉・解析の方法を確立することに重点をおいた実験を進めた。その結果、微量であるドリコール二リン酸結合型糖鎖の検出および定量的な解析に成功し、最終産物であるタンパク質上のN結合型糖鎖、さらには分解物である遊離糖との3者を定量的に比較解析をN結合型糖鎖の生合成過程として表現することが可能となった。代表的なERストレス誘導試薬であるツニカマイシンおよびタプシガルギンを添加してERストレスを誘導し、その過程、およびストレスの度合いを、N結合型糖鎖に纏わる3種の糖鎖構造を統合して表現する方法論の確立を現在行っている。 N結合型糖鎖前駆体のドリコール二リン酸結合型糖鎖の生合成を阻害するツニカマイシン添加では、経時的にN結合型糖鎖全体の量が減少したことを確認し、対照実験として本法が機能していることを示した。カルシウムチャネル阻害によるERストレスを誘導するタプシガルギン添加では、経時的に増加する糖鎖、または大きく減少する特定の糖鎖構造が明らかになり、これらの糖鎖をERストレスを示すマーカーとして特許を取得することを考えている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由所属研究機関の異動による環境変化が生じ、当初やや進捗の遅れが予想されたが、現有設備の充実もあり、概ね順調に研究を遂行することができた。 3種の糖鎖は生体サンプルから糖鎖を選択的に捕捉できるグライコブロッティング法を用いて行った。N結合型糖鎖修飾の産物であるタンパク質上の糖鎖、および生合成過程で生ずる分解物である遊離糖は、感度および分解能の観点から、本研究遂行者による過去の報告を上回るクオリティで達成することができた。前駆体であるドリコール二リン酸結合型糖鎖は微量のため、N結合型糖鎖と分解物の検出のための細胞数のおよそ10倍量が必要であったが、検出および定量を可能にすることに成功した。質量分析に供する前にドリコール二リン酸結合型糖鎖と遊離糖は、分子量による区別がつかないことから、厳密に分離する必要があったため、その分離方法の確立を重点的に行った。伝統的な手法によるドリコール二リン酸結合型糖鎖の精製は非常に大量の出発細胞が必要であり、また、混合物から選択的に糖鎖を補足するグライコブロッティング法の利を生かせないことから、同時に観測されてしまう遊離糖との分離を達成しつつ、効率的にドリコール二リン酸結合型糖鎖を観測できる方法を確立することができた。また、N結合型糖鎖の生合成過程をレポーターとしたERストレス度判定が、実現可能であり確かなものであることを担保するために、糖鎖構造解析と並行して、既知のERストレスマーカーの検出によるERストレスの判定も進め、既存の方法との比較も行った。
今後の研究の推進方策	現在までに、タンパク質上のN結合型糖鎖、生合成過程におけるそれらの分解物である遊離糖、さらに前駆体であるドリコール二リン酸結合型糖鎖の3種の糖鎖を同一の方法によって定量的な構造解析を行うことを可能にした。このようなN結合型糖鎖の生合成過程を定量的に表現することを「総合Nグライコーム解析」として提案することを今後目指す。また、この総合Nグライコーム解析によるERストレス度の指標策定を今後重点を置いて進める予定である。また、倫理委員会承認の上、臨床検体サンプルを用いて、病巣部と正常部の比較や、治療前後の比較により、N結合型糖鎖の生合成過程をレポーターとしたERストレス判定から、診断および治療効果判定の方法論を確立することを目指して研究を遂行する予定である。
次年度使用額が生じた理由	所属研究機関を異動した結果、異動先の現有設備の充実により、購入を予定していた器具などを購入せずに、目標までの実験を行うことが出来たため。次年度において、選択的な糖鎖捕捉試薬を購入するとともに、外部機関の機器使用料の支払いに充てる予定である。