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2020 年度 実績報告書

反応中間体の構造解析によるマルチ銅オキシダーゼの酸素還元機構の解明と応用

研究課題

研究課題/領域番号 18K05432
研究機関金沢大学

研究代表者

片岡 邦重  金沢大学, 物質化学系, 教授 (40252712)

研究分担者 山下 哲  金沢大学, 物質化学系, 准教授 (70361186)
研究期間 (年度) 2018-04-01 – 2021-03-31
キーワードマルチ銅オキシダーゼ / 構造解析 / 指向進化 / 反応機構 / 一価銅酸化酵素
研究実績の概要

マルチ銅オキシダーゼ(MCO)は,分子内に4個の銅イオンを含む酸化還元酵素で,タイプⅠ銅で基質を酸化した電子を用いて,タイプⅡ, Ⅲ銅からなる三核銅部位で酸素を4電子還元し水を生成する反応を触媒する。MCOは,系外に活性酸素種を放出することなく分子状酸素を水にまで還元できるが,その詳細な反応機構は明らかではない。本研究では,MCOの一種である大腸菌の一価銅酸化酵素CueOと糸状菌のビリルビン酸化酵素を対象に,X線結晶構造解析,中性子線構造解析による酸素還元反応中間体の構造解析を目指している。また,進化分子工学的手法を用いて酸素還元中心近傍へ変異を導入することにより,酸素還元反応の直接制御技術を得ることも目的としている。
本研究では,反応中間体の構造解析において,中間体が安定化したCueO三重変異体を作製し,軽水中で結晶化条件を検討したところ,これまでになく大きな直方体型結晶を得た。この結晶を使用したX線回折実験の結果,2.8Å分解能程度までの反射が得られ,野生型CueOの結晶構造を用いた分子置換法により位相を決定した。現在,中性子線回折実験に向け重水系での結晶化条件の検討を行っており,反応中間体構造の解明が期待される。
CueOの進化分子工学では,新規の高活性化アミノ酸置換体,F210L,G304E,M305I,F310S,E476G,及びL502Vを得た。これらはいずれもタイプⅠ銅遠位に位置する活性制御部位で,野生型酵素のABTS酸化活性と比較して4倍から20倍の活性化が観察された。更に,上記L502Vをベースとする指向進化により,活性が最大57倍に増大した変異体の作出にも成功した。一部の変異体はX線結晶構造解析により高活性化の構造的要因を検討した。本研究で得られた知見は,MCOの反応制御に新たな方法論を与え,MCOの産業応用に大きく貢献するものである。

  • 研究成果

    (8件)

すべて 2020

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (4件)

  • [雑誌論文] Effects of Elimination of α Helix Regions on Direct Electron Transfer-type Bioelectrocatalytic Properties of Copper Efflux Oxidase2020

    • 著者名/発表者名
      ADACHI Taiki、KITAZUMI Yuki、SHIRAI Osamu、KAWANO Tenta、KATAOKA Kunishige、KANO Kenji
    • 雑誌名

      Electrochemistry

      巻: 88 ページ: 185~189

    • DOI

      10.5796/electrochemistry.20-00015

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Crystal structure of chalcone synthase, a key enzyme for isoflavonoid biosynthesis in soybean2020

    • 著者名/発表者名
      Imaizumi Riki、Mameda Ryo、Takeshita Kohei、Kubo Hiroki、Sakai Naoki、Nakata Shun、Takahashi Seiji、Kataoka Kunishige、Yamamoto Masaki、Nakayama Toru、Yamashita Satoshi、Waki Toshiyuki
    • 雑誌名

      Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics

      巻: 89 ページ: 126~131

    • DOI

      10.1002/prot.25988

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Roles of the indole ring of Trp396 covalently bound with the imidazole ring of His398 coordinated to type I copper in bilirubin oxidase2020

    • 著者名/発表者名
      Kataoka Kunishige、Ito Takahiro、Okuda Yoko、Sakai Yoko、Yamashita Satoshi、Sakurai Takeshi
    • 雑誌名

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      巻: 521 ページ: 620~624

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2019.10.159

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Diffusion-limited biosensing of dissolved oxygen by direct electron transfer-type bioelectrocatalysis of multi-copper oxidases immobilized on porous gold microelectrodes2020

    • 著者名/発表者名
      Miyata Masahiro、Kitazumi Yuki、Shirai Osamu、Kataoka Kunishige、Kano Kenji
    • 雑誌名

      Journal of Electroanalytical Chemistry

      巻: 860 ページ: 113895~113895

    • DOI

      10.1016/j.jelechem.2020.113895

    • 査読あり
  • [学会発表] 大腸菌発現ビリルビンオキシダーゼへの部位特異的ポリエチレングリコール付加2020

    • 著者名/発表者名
      伊藤晟,山下哲,櫻井武,片岡邦重
    • 学会等名
      第93回日本生化学会大会
  • [学会発表] 貝紫合成に関与するブロモペルオキシダーゼの可溶性成分の精製2020

    • 著者名/発表者名
      熊川初香,東田海斗,山下哲,片岡邦重
    • 学会等名
      第93回日本生化学会大会
  • [学会発表] 大腸菌発現型ビリルビンオキシダーゼの性質2020

    • 著者名/発表者名
      片岡邦重
    • 学会等名
      第461回ビタミンB研究協議会
  • [学会発表] Clostridium beijerinckii由来マルチ銅オキシダーゼのタイプⅠ銅部位への変異導入2020

    • 著者名/発表者名
      寺西梨来,三原早織,山下哲,片岡邦重
    • 学会等名
      2020年度日本化学会近畿支部 北陸地区研究発表会

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公開日: 2021-12-27  

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