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2023 年度 実績報告書

生体認識配糖体生産のための特異的糖鎖遊離酵素の構造解析とその機能開発

研究課題

研究課題/領域番号 18K05444
研究機関大阪公立大学

研究代表者

伊藤 和央  大阪公立大学, 大学院理学研究科, 准教授 (20183171)

研究期間 (年度) 2018-04-01 – 2024-03-31
キーワード生体認識配糖体 / エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ / 立体構造
研究実績の概要

2018~2022年度は、組換エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(エンド)HSとSe-Met置換組換エンドHSの板状単結晶を調製し、X線結晶回析測定と単波長異常散乱法での位相決定から、分解能1.95Åの立体構造を解明した。エンドHSは、GHF85酵素類似ドメインI~IIIとC末端側の新規ドメインIVとVから構成されていた。
また、分離菌Prevotella melaninogenica 由来エンドPMの3つのアイソザイムのうち、組換エンドPMαの板状単結晶のX線結晶回析から分解能2.1Åの立体構造を解明した。エンドPMαはN末端側からI~V のドメインで構成され、ドメインIは(α/β)8バレルで、触媒アミノ酸が存在する触媒ドメインであった。ドメインII~Vは異なるβバレルで、ドメインIVとVは他のGHF85酵素に存在しなかった。外膜移行モチーフを含むドメインVは、本酵素の菌体外膜移行ドメインと考えられた。低角X線散乱法で解析したエンドPMαの立体構造は非対称形で、実験散乱曲線と理論曲線のχ2 値が異なり、結晶と溶液では構造が異なると考えられた。
最終年度は、GHF85酵素の3つの触媒アミノ酸に相当するエンドHSのN216 、E218、Y252の機能を検証した。1アミノ酸置換N216A、E218Q、E218A酵素の各活性は野生型酵素の1/1000以下で、Y252F酵素は1/7、GHF85酵素ではFであるY282のY282F酵素は1/50となった。2アミノ酸置換N216A/Y252F酵素は野生型酵素の1/10000以下で、N216A/E218QやE218Q/Y252F酵素と3アミノ酸置換N216A/E218Q/Y252F酵素の活性は検出不可であった。エンドHSはE218を中心に、N216、E218、Y252、Y282の4アミノ酸残基が触媒部位を構成していると考えられた。

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2024 2023 その他

すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (1件) (うち国際共著 1件、 査読あり 1件) 学会発表 (4件) (うち国際学会 1件)

  • [国際共同研究] チュラロンコン大学理学部/ラムカンヘン大学理学部/カセサート大学教養学部(タイ)

    • 国名
      タイ
    • 外国機関名
      チュラロンコン大学理学部/ラムカンヘン大学理学部/カセサート大学教養学部
  • [雑誌論文] Structure and function of endo-β-N-acetylglucosaminidase PM responsible for deglycosylation of host glycoproteins in Prevotella melaninogenica2023

    • 著者名/発表者名
      Tomofumi Takeuchi, Shinji Mori, Kazuki Okura, Methus Kuraeokura, Santhana Nakapong, Nobuo Kamiya, Ikuko Miyahara and Kazuo Ito
    • 雑誌名

      Abstract and Proceeding Book of 30th FAOBMB & 8th BMB Conference (https://www.bmbconference.org/faobmb2023/wp-content/uploads/2023/12/FAOBMB_2023_Abstract-Book.pdf)

      巻: - ページ: 402-408

    • 査読あり / 国際共著
  • [学会発表] エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼHSの立体構造と機能発現機構2024

    • 著者名/発表者名
      倉内郁也 、大倉和貴、森 真司 、米澤健人、清水伸隆、田中里佳、細川千絵、宮原郁子、伊藤和央
    • 学会等名
      2024年日本農芸化学会大会(於東京)(2024年3月25~27日)
  • [学会発表] エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼHSの構造と機能発現2023

    • 著者名/発表者名
      倉内郁哉、大倉和貴、森 真司、米澤健人、清水伸隆、田中里佳、細川千絵、宮原郁子、伊藤和央
    • 学会等名
      第23回関西グライコサイエンスフォーラム(於大阪)(2023年5月20日)
  • [学会発表] エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼHSの立体構造とその機能発現2023

    • 著者名/発表者名
      倉内郁也、大倉和貴、森 真司、米澤健人、清水伸隆、田中里佳、細川千絵 、宮原郁子 、伊藤和央
    • 学会等名
      第95回日本生化学会大会(於福岡)(2023年10月31日~11月2日)
  • [学会発表] Structure and function of endo-β-N-acetylglucosaminidase PM responsible for deglycosylation of host glycoproteins in Prevotella melaninogenica2023

    • 著者名/発表者名
      Tomofumi Takeuchi, Shinji Mori, Kazuki Okura, Methus Kuraeokura, Santhana Nakapong, Nobuo Kamiya, Ikuko Miyahara and Kazuo Ito
    • 学会等名
      30th FAOBMB&8thBMB Conference・Bangkok(November 22~23, 2023)2~25日)
    • 国際学会

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公開日: 2024-12-25  

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