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2018 年度 実施状況報告書

コナダニ類の脂質代謝に関わる酸化的な炭素鎖短縮反応の分子基盤

研究課題

研究課題/領域番号 18K05468
研究機関京都学園大学

研究代表者

清水 伸泰  京都学園大学, バイオ環境学部, 准教授 (30434658)

研究期間 (年度) 2018-04-01 – 2021-03-31
キーワードコナダニ / 脂質代謝 / 生合成 / Baeyer-Villiger酸化 / ギ酸エステル / 炭化水素
研究実績の概要

ダニ類は厳しい外的環境にも適応できる脂質代謝機構をもつことで高い生存能力を発揮している。特に動物の必須脂肪酸であるリノール酸の生合成能をもつことは生理学的な重要性だけでなく、様々な生物機能が知られる炭化水素やエステルなどの生合成にも深く関与している。我々はこれまでコナダニ特有の炭化水素やギ酸エステルなどのデノボ合成に着目し、ダニ類に同位体標識化合物を取り込ませるトレーサー実験を行ってきた。その成果として、炭化水素とギ酸エステルはともに脂肪族アルデヒドを経由して生合成されると仮説を立てたことにより、どの生物種からも未発見の酸化的な炭素鎖短縮反応の関与が明らかとなった。そこで今年度は、アルデヒドからBaeyer-Villiger酸化を経てギ酸エステルに変換する酵素を、次の二つのアプローチから同定することを目的に研究を進めた。1) コナダニを大量繁殖させて粗酵素液を調製し、遠心分離法によって得た画分に酵素活性を認めた。界面活性剤を用いて酵素の可溶化条件を決定できたので、硫安による塩析と各種クロマトグラフィーによる精製を進めて、アミノ酸配列を解析する予定である。2) 次世代シーケンサーを用いた塩基配列解析などにより、推定生合成遺伝子群を絞り込んだ。異種発現系により候補遺伝子の酵素機能を調べるため、ダニからmRNAを抽出し、cDNAを合成後、これをテンプレートとして候補遺伝子をクローニングしている。これらをタンパク質発現ベクターに挿入し、大腸菌にて融合タンパク質を異種発現させようと試みている。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

新規なBaeyer-Villiger 酸化に関与する酵素の同定を目指した。大量飼育したコナダニから粗酵素液を調製して、遠心分離法によって得た沈殿画分に酵素活性が認められた。酵素活性はアルデヒドを基質として加えてギ酸エステルへの変換の有無で判断した。沈殿画分にTriton X-100を添加すると酵素が可溶化できたため、膜タンパク質および核タンパク質である可能性が示唆された。目的の酵素を同定するもう一つのアプローチとして、トランスクリプトーム解析を行った。本種ダニのようにゲノム配列の分かっていない非モデル生物でもde novo RNA-seq を行うことで、RNA分子の情報を網羅的に調べることができる。得られたトランスクリプトーム塩基配列をもとに既知のBVMOと配列類似性を示すタンパク質を検索したところ、6種のタンパク質が特有のモチーフ配列をもつことが明らかとなった。

今後の研究の推進方策

粗酵素を用いた活性評価法が確立できたため、今後はさらに硫安による塩析やゲル濾過、各種クロマトグラフィー等による精製を進めて、アミノ酸配列の決定を目指す。また、de novo RNA-seqで得られたトランスクリプトーム塩基配列について、Blast検索を含めたジーンオントロジー解析を行うことで付与されたアノテーションから、既知のBVMOと配列類似性を示すタンパク質を絞り込んだ。現在、異種発現系により候補遺伝子の酵素機能を調べるため、ダニ由来の候補遺伝子をクローニングしている。これが終了し次第、タンパク質発現ベクターに挿入し、大腸菌にて融合タンパク質を異種発現させる。

次年度使用額が生じた理由

購入予定であったGC/MS用キャピラリーカラムとHPLC用カラムが所属機関の公費で賄えた。また経費の掛かるトランスクリプトーム解析を他の研究助成金で支払えたため、繰り越した分は2019年度の消耗品、成果発表、委託費などで使用する予定である。

  • 研究成果

    (11件)

すべて 2019 2018 その他

すべて 雑誌論文 (1件) 学会発表 (7件) (うち招待講演 1件) 備考 (2件) 産業財産権 (1件)

  • [雑誌論文] ダニと昆虫の多機能フェロモンとその活用術2018

    • 著者名/発表者名
      清水伸泰
    • 雑誌名

      昆虫と自然

      巻: 53 ページ: 4-7

  • [学会発表] コナダニ類の警報フェロモンneryl formate分子を形成するギ酸の生合成2019

    • 著者名/発表者名
      森山太介、吉田直樹、清水伸泰
    • 学会等名
      日本農芸化学会
  • [学会発表] ワラジムシ由来の防御物質キナルジン酸誘導体の同定と生物活性評価2019

    • 著者名/発表者名
      永井禎己、石丸善明、唐澤重考、清水伸泰
    • 学会等名
      日本農芸化学会
  • [学会発表] シキミグンバイ若虫分泌物とその類縁体の抗菌活性評価2019

    • 著者名/発表者名
      高原千尋、清水伸泰
    • 学会等名
      日本農芸化学会
  • [学会発表] 微小な衛生・不快害虫のフェロモン研究からわかってきたこと2018

    • 著者名/発表者名
      清水伸泰
    • 学会等名
      日本環境動物昆虫学会セミナー
    • 招待講演
  • [学会発表] 日本産タマヤスデの防御分泌物に含まれるアルカロイドとタンパク質2018

    • 著者名/発表者名
      清水伸泰、井上萌佳、小野淳也
    • 学会等名
      日本土壌動物学会
  • [学会発表] 節足動物の防御物質を用いた殺虫および殺ダニ効果の検証2018

    • 著者名/発表者名
      清水伸泰、小野淳也、平坂高一、市川直美、川瀬穂高
    • 学会等名
      日本環境動物昆虫学会
  • [学会発表] シキミグンバイ若虫分泌物に含まれる抗菌活性物質の構造活性相関研究2018

    • 著者名/発表者名
      高原千尋、清水伸泰
    • 学会等名
      日本環境動物昆虫学会
  • [備考] 個人ホームページ

    • URL

      https://lab.kuas.ac.jp/~bioorgchem/

  • [備考] 京都先端科学大学、教員紹介

    • URL

      https://www.kuas.ac.jp/profile/nobuhiro-shimizu

  • [産業財産権] グンバイ由来ポリケチドとその合成類縁体の抗菌活性2019

    • 発明者名
      高原千尋、清水伸泰
    • 権利者名
      高原千尋、清水伸泰
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      2019-55710

URL: 

公開日: 2019-12-27  

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