| 研究課題/領域番号 |
18K05468
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| 研究機関 | 京都先端科学大学 |
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研究代表者 |
清水 伸泰 京都先端科学大学, バイオ環境学部, 教授 (30434658)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | コナダニ / 生合成 / 脂質代謝 / Baeyer-Villiger酸化 / ギ酸エステル / 炭化水素 |
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| 研究実績の概要 |
これまで同位体標識化合物をコナダニ体内に取り込ませ、それに関連する代謝物の標識パターンと同位体比率を解析することにより、昆虫とは異なる新たな酵素および生成機構が関与することを実験的に証明してきた。生体内における基礎的な脂肪酸の代謝研究を足掛かりとして、特に個体の生存や情報伝達に重要な役割を果たす炭化水素と脂肪族ギ酸エステルに着目して生合成研究を展開してきた。その成果として、炭化水素と脂肪族ギ酸エステルはともにアルデヒドを共通の鍵前駆体と仮定したことにより、両化合物はコナダニ特有の酸化的な炭素鎖短縮反応の産物であることが分かってきた。昨年度に引き続き炭化水素合成酵素とBaeyer-Villiger酸化酵素の同定を目指して、同位体標識化合物を利用した酵素反応の検討および酵素の精製、さらに今年度からはコナダニで広くフェロモン活性が報告されているギ酸ネリルの生合成について、昆虫での報告例を基にした仮説の検証を行った。
これまでダニ粗酵素液に目的物に相当する前駆体アルデヒドを加えて、変換反応の有無を手掛かりとして段階的に酵素の精製を進めてきた。炭化水素合成酵素とBaeyer-Villiger酸化酵素はいずれもミクロソーム画分にのみ酵素活性が確認できた。同位体標識アルデヒドを基質とした実験では、同位体標識された炭化水素を得ることに成功した。現在、脂肪族ギ酸エステルについても同様の実験で検証を進めている。ギ酸ネリルの生合成については、特に生体内でのギ酸生成機構に着目しており、推定した前駆体アミノ酸の摂食実験を通して合成経路の特定を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
炭化水素の生合成については酵素反応の条件が確立しつつあり、酵素の同定を目指して各種クロマトグラフィー等による精製を進めている。一方、脂肪族ギ酸エステルについては、反応で加える基質と生成物のGC保持時間がオーバーラップしたことで、カラム条件を変更したり、粗生成物の精製法を検討したりと活性評価の面でかなりの時間を要した。徐々にではあるが条件が整いつつあるため今後、同位体標識アルデヒドを基質とした酵素反応を実施する。ギ酸ネリルの生合成については、同位体標識アミノ酸をダニに摂食させて、ギ酸炭素が標識されるかで合成経路の検証を行っている。グリシンとセリンが由来であることが確かめられたが、アリ類で行われたギ酸生合成の研究結果では説明のできない新たな合成経路を経由している可能性が示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
脂肪族ギ酸エステルにおける酵素活性の評価法が確立でき次第、粗酵素の硫安による塩析やゲル濾過、各種クロマトグラフィー等による精製を進めて、アミノ酸配列の決定を目指す。炭化水素合成酵素については精製工程を無理なく先に進めるために、ダニの大量飼育法の検討、効率的な粗酵素の抽出および分画法を確立する。ダニにおけるギ酸ネリルの合成経路を同位体標識アミノ酸およびその類縁体を用いて決定する。ダニ由来のモノテルペンはメバロン酸経路を経由することが判明しているため、最終工程のネロールとギ酸との縮合、特にギ酸分子の由来が不明である。今年度の取り込み実験で得られた知見をもとに、アリ類の防御物質として知られるギ酸の合成経路にはない、ダニ特有の新たな合成経路が存在することを実験的に証明する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度購入した凍結乾燥機が想定より安価に導入できたことに加えて、比較的高価な精製用のカラムを所属機関の公費および他の研究助成金を使って購入できた。繰り越した分は2020年度の国際学会の参加費・渡航費に充てる予定であったが、新型コロナウイルスの影響で学会が不開催となったため、その分は論文投稿費用、委託費、人件費などに切り替えて使用する予定である。
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