| 研究課題/領域番号 |
18K05469
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
鵜沢 浩隆 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 材料・化学領域, 上級主任研究員 (60356566)
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| 研究分担者 |
平塚 淳典 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 材料・化学領域, 研究グループ長 (70392652) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 糖脂質 / ケモエンザイム合成 / 相互作用解析 / 検知チップ / 固定化 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、Clostridium botulinumの生産する蛋白性神経毒素（以下、BTXとする）と各種糖脂質との相互作用を検証することを目的としている。本年度は、糖脂質ライブラリーの拡充を図るため、昨年度に引き続き、開発したケモエンザイム法を用いて、人工糖脂質リガンドの合成について検討した。すなわち、植物由来GM3セラミド（3糖）、および、乳由来GM3セラミド（3糖）について、Sphingolipid ceramide N-deacylaseを作用させ、2本鎖セラミドのアミド結合について選択的加水分解を行った。その結果、アミノ基遊離の植物型lysoGM3（収率 80%）、および、乳由来lysoGM3（収率 35%）をそれぞれ得た。次に、植物型lysoGM3について、DMF中、NHS活性化リポ酸と反応させ、ジスルフィド結合を有するアンカーを遊離のアミノ基に導入し、目的の植物型GM3-TOA（収率 64%）を合成した（TOAはリポ酸を意味する）。これまでのところ、GT1b-TOA、GT1a-TOA 、GD1b-TOA 、GM1-TOA、Gb3-TOA、GM3-TOA（植物型）、Lac-TOA、Gal-TOA、Glc-TOAについて合成が完了した。
次に、単一分子量 (300kDa)の毒素実剤BTX/Eを用い、Lac-TOA/MTPEG4を固定化した金電極（チップ）に対する応答を水晶振動子マイクロバランス（QCM）法により評価した。毒素絶対量として200ng相当のBTX/Eにおいて、少なくとも約11 Hzの周波数変化があった。Lac-TOAに対しては、BTX/Bの結合が文献で報告されているが、調べた限りBTX/Eについては知られていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
新型コロナ感染症による緊急事態宣言が発せられ、2020年4月～5月末まで、リモートワークとなり、実験が中断した。又、本研究では、感染症法指定の病原体を取り扱っているが、コロナ感染症のため、N95マスク等の資材の入手が困難となり、実験中断を余儀なくされた。そのため、実剤の毒素を用いた研究に遅れが出ている。
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| 今後の研究の推進方策 |
N95マスクを入手し、本研究で作製した糖脂質固定化チップを用いて、毒素/擬剤との相互作用解析を早急に実施する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナ感染症による実験中断、および、資材の枯渇により、毒素や擬剤を用いた実験に遅れが出ており、1年間の研究期間延長を申請した。次年度においては、本研究で開発した糖脂質ライブラリーを活用し、糖脂質固定化チップの作製、および、毒素/擬剤を用いた相互作用解析を実施する。これらの実験に必要な試薬、溶媒、金チップ（電極）等の消耗品を購入する。又、合成した糖脂質リガンドはチップ作製に用いるが、必要に応じて追加の合成を行うことがある。その場合には追加合成のための試薬を購入する。又、枯渇した資材の調達を行う。
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