| 研究課題/領域番号 |
18K05469
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
鵜沢 浩隆 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 材料・化学領域, 上級主任研究員 (60356566)
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| 研究分担者 |
平塚 淳典 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 材料・化学領域, 総括研究主幹 (70392652) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 糖脂質 / 合成 / ガングリオシド / 検知チップ / 相互作用解析 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、Clostridium botulinumの生産する蛋白性神経毒素（以下、BTXとする）と各種合成糖脂質との相互作用を検証することを目的としている。昨年度までに、7糖GT1b-TOA、5糖GM1-TOA、2糖Lac-TOA、1糖Glc-TOAの各糖脂質誘導体を金表面に固定化を行い、これらの検知チップを用いて、単一分子量 (300kDa)の毒素実剤BTX/Eについて、水晶振動子マイクロバランス法（QCM）による結合評価を行った。本年度は、単一分子量 (51kDa)の神経毒素重鎖(BTX/A/Hc)を用い、GT1b-TOA、GM1-TOA、Lac-TOA、Glc-TOAとの結合相互作用について検証した（TOAはリポ酸を意味する）。
まず、４種類の合成糖脂質Glc-TOA、Lac-TOA、GM1-TOA、及び、GT1b-TOAを、各々、センサ基板の金表面に自己集積化膜（SAM）法により固定化した。同様にして、SAM法により、検知チップのレファレンス側にHOEG6C11SHを固定化した。遺伝子組換え体重鎖BTX/A/Hcを用い、Glc-TOA、Lac-TOA、GM1-TOA、GT1b-TOAを固定化した各検知チップについて、30 MHz QCMによる結合評価を行った。200ngのBTX/A/Hcを注入した時、Glc-TOA、及び、GT1b-TOAでは、各々、7.3 Hz、5 Hzの周波数減少が認められた。一方、Lac-TOA、GM1-TOAでは、周波数減少は見られなかった。本実験で使用したBTX/A/Hcには、タンパク安定化のため過剰量のラクトースを含有しているため、結合阻害している可能性がある。今後は、ラクトースを除去した試料を調製して再評価を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
新型コロナウイルス感染症のため、合成糖脂質を固定化するための水晶振動子チップが枯渇しており、受注生産に４か月以上要したため、毒素検知評価実験に遅延が生じた。しかし、その後、重点的に検知実験を実施し、遅れを取り戻しつつある。また、実験に使用した遺伝子組換え体BTX/A/Hcには、保存安定剤が含まれており、これが検知実験の阻害剤として機能することが判明した。そのため、実験に使用する試料について、BTX/A/Hcに過剰に含まれる阻害物質を精製・除去して、今後の実験に供する。
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| 今後の研究の推進方策 |
遺伝子組換え体BTX/A/Hcに含有する阻害物質を除去する方法を検討し、阻害物質を含まない試料を調製する。その後、精製した組換え体重鎖BTX/A/Hcを用いて、４種類の糖脂質固定化チップに対する検知評価を実施する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナ感染症の影響による部材供給に時間がかかり、毒素検知実験にやや遅れが出ており、1年間の研究期間延長を申請した。次年度においては、本年度に得た知見をもとに、糖脂質固定化チップの作製、組換え体に含まれる阻害物質の精製・除去する方法を早期に確立し、精製した試料を用いた相互作用解析を実施する。そのための水晶振動子チップ、試料精製のための部材、チップを固定化するための溶媒等の消耗品を購入する。又、合成した糖脂質リガンドはチップ作製に用いるが、必要に応じて追加の合成を行うことがある。その場合には追加合成のための糖脂質原料、酵素等の試薬を購入する。
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