| 研究課題/領域番号 |
18K05480
|
|---|
| 研究機関 | 東京農業大学 |
|---|
研究代表者 |
服部 一夫 東京農業大学, 応用生物科学部, 教授 (10385495)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | 腸管オルガノイド / デオキシニバレノール / ニバレノール / 幹細胞 / タイトジャンクション / 管腔側 / 基底膜側 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、腸管オルガノイド(三次元的に生体外で作られた腸管:外側は基底膜側、内側は管腔側の構造)を用いて、(1)腸管に影響を引き起こすカビ毒のデオキシニバレノール (DON) とニバレノール (NIV) が、幹細胞やタイトジャンクションなどに対する影響を調べ、これまでのin vitro系の結果と比較し、当該オルガノイド評価系の妥当性を検討する、(2)オルガノイド評価系の結果と当該カビ毒を投与したマウスの腸管における変化の結果を比較検討することである。これにより、DONやNIVの腸管の幹細胞に与える影響といった新規の情報を提示するだけでなく、腸管オルガノイド評価系の有用性を示し、動物に替わる新たな安全性評価系の構築につなげたい。本年度は、DONおよびNIVを管腔側あるいは基底膜側から暴露した際の幹細胞とタイトジャンクションなどへの影響を比較検討した。その結果、管腔側からの暴露により、小腸バリア機能およびタイトジャンクションなどに関連したタンパク質の低下、幹細胞数の減少が認められた。また、基底膜側から暴露の影響が大きい理由を探るため、RNA-sequence解析を行った。その結果、発現変動遺伝子 (DEGs) のヒートマップが明確に異なっており、変動した発現変動遺伝子の数も多かった。さらに、DAVIDを用いたエンリッチメント解析の結果、Focal adhesion pathwayが最も変動が大きかった。以上より、DONおよびNIVは、管腔側からよりも基底膜側からの暴露により、小腸バリア機能、タイトジャンクションなどに負の影響を及ぼし、腸管幹細胞数の減少も生じることが明らかとなった。また、DONにおいては、基底膜側からの暴露の方が変動する遺伝子が明らかに多く、特にFocal adhesion pathwayの関与が大きいことが示唆された。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、腸管オルガノイドに対して、DONとNIVを基底膜側から暴露した場合 (培地に添加) と管腔側から暴露した場合 (マイクロインジェクションによる添加)、タイトジャンクションなどや幹細胞にどのような影響を及ぼすのかを比較検討することを目的とした。小腸バリア機能、アクチン (細胞骨格マーカー)、タイトジャンクション構成タンパク質 (ZO-1, Claudin-2, Occludin)、細胞接着タンパク質 (E-cadherin) の変化を調べた結果、DONならびにNIV (ともに1 uM) においては、管腔側からの暴露により、小腸バリア機能ならびにこれらのタンパク質の低下が認められた。次に、幹細胞に対する影響を調べた結果、管腔側からのDONあるいはNIVの暴露により幹細胞数が減少した。さらに、管腔側あるいは基底膜側からDONに暴露された腸管オルガノイドのRNA-sequence解析を行った。その結果、基底膜側からの暴露は、発現変動遺伝子 (DEGs) のヒートマップが明確に異なっており、変動したDEGsの数も約8倍多かった。さらに、DAVIDを用いたエンリッチメント解析の結果、Focal adhesion pathwayが最も変動が大きかった。以上より、DONおよびNIVは、管腔側からよりも基底膜側からの暴露により、小腸バリア機能、タイトジャンクションなどに負の影響を及ぼし、腸管幹細胞数の減少も生じることが明らかとなった。また、DONにおいては、基底膜側からの暴露の方が変動する遺伝子が明らかに多く、特にFocal adhesion pathwayの関与が大きいことが示唆された。以上より、本年度の研究計画の目的はほぼ達成されており、学術雑誌への投稿も近日中に行うことからも、進捗状況は「おおむね順調に進展している」と判断した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、DONおよびNIVを経口投与したマウスの腸管における変化を調べる。PBS, DON, NIVを経口投与したC57BL/6マウスあるいはLgr5-EGFPマウスから腸管の切片を作製し、絨毛やクリプトの変化、幹細胞由来Lgr5の蛍光強度の変化、免疫染色を用いて腸管上皮細胞 (杯細胞、パネート細胞、吸収上皮細胞、内分泌細胞、タフト細胞) への影響や、タイトジャンクションなどのタンパク質の変化を調べる。また、マウスにカビ毒を経口投与後、蛍光標識物質を経口投与し、血中の蛍光標識物質量を測定し、小腸のバリア機能の変化を調べる。これらの結果を、H30年とR1年度に行ったin vitroのオルガノイド系の結果と比較検討する予定である。これまでに予備実験として、報告された投与量でDONを経口投与したが、腸管での大きな変化は認められなかった。これは、DON単独では胃からもかなり吸収されるため、腸管に移行しにくいためと考えられた。そのため、in vivoでの評価に関しては、(1) DONやNIVの投与量を高くする、(2) 胃からの吸収を抑えるためにDONやNIVを含有させた飼料を与える、などの検討が必要であると予想された。予備実験において、50 mg/kgという高用量のDONを与えたマウスの腸管から作成したオルガノイドでは、オルガノイドの形成率や増殖能の低下が認められた。次年度は、まず、in vivoにおいて腸管に影響が生じるDONとNIVの投与量や投与方法を決定する必要がある。これらが決定できれば、その後の測定項目に関しては順調に進められると考えている。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
試薬および器具の購入に使用したが、必要な試薬や器具が購入できない程度の少額がやむなく生じた。次年度の試薬・器具の購入のための一部として使用する予定である。
|
