| 研究課題/領域番号 |
18K05488
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
臼井 真一 岡山大学, 保健学研究科, 准教授 (50346417)
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| 研究分担者 |
廣畑 聡 岡山大学, 保健学研究科, 教授 (90332791)
柴倉 美砂子 岡山大学, 保健学研究科, 准教授 (30314694)
篠畑 綾子 岡山大学, 保健学研究科, 助教 (70335587)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | エタノール / HDL / 動脈硬化 / HepG2 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は，HepG2細胞のHDL生合成におけるエタノールの影響を検討するために，培養液に添加するエタノール条件（濃度，期間）を主に検討した。
1.エタノールの単回添加（0～2％，24ｈ）ではエタノール濃度依存性に細胞生存率が低下し，特に細胞数が少ない状態でその傾向が顕著であった。細胞数が多い場合はエタノール1％までは有意な生存率低下を認めなかったが，培養上清に出現するHDLへのエタノールの影響は有意ではなかった。培養上清のアポBとアポEはエタノール濃度依存性に増加したが，HDLの構成蛋白であるアポA１は明らかな増加が見られなかった。一方，HDL受容体（SR-BI）の蛋白質発現は，エタノール濃度高値で変動する傾向が見られた。
2.エタノールは細胞による消費だけでなく，揮発による培地内濃度低下を考慮する必要がある。そこで，エタノールの複数回添加（0～1％，12～24ｈ毎に2～4回添加）による培養を検討した。また，培養液内に出現するHDLは短期間培養では検出困難なため，70～100％コンフルエント状態で1～4日間培養を維持できる条件も併せて検討した結果，エタノール添加時にグルコースを同時に添加することが有効であった。エタノールの複数回添加実験では，エタノールによるHDL-コレステロールの増加傾向が見られ，現在再現性を確認している。HDL生合成に関与する蛋白質（ABCA1，ABCG1, LXRなど）の発現量はエタノールによる有意な変動はこれまで認められなかった。
3.エタノールによるHDLの増加傾向がエタノール代謝を阻害する試薬（4-メチルピラゾール）で抑制されるかを検討したところ，予想に反して4-メチルピラーゾール自体がHDLの生合成へ影響を与える可能性が生じた。エタノール代謝に関連するCPY3A4を強制発現したGS-3A4-HepG2を用いての検討を現在実施している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
細胞培養条件およびウェスタンブロッティングの分析条件の決定に予想よりも時間を要している。また，既報や予想と異なるデータがしばしば得られ，その原因追及にも時間を要しており，やや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度に引き続き細胞培養を用いてエタノールのHDL生合成へ与える影響およびそのメカニズムを検討する。また，当初の研究計画に基づき動物実験を開始する。マウスに与えるエタノール量や期間は既報を参考に進めていく予定であるが，細胞培養実験のように予想通りの結果が得られない場合は，ラットや疾患モデルマウスなどを利用することを考慮しながら研究を進める。動物からは血液，肝臓等を採取し，血清脂質分析やmRNA発現，蛋白質発現を解析する。この実験により，エタノール摂取と血中HDLの変動，および肝におけるHDL関連蛋白質の発現変動との関連を明らかにしていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
細胞培養実験が予測通りの結果が得られず，実験に必要な試薬等の費用に差異が生じた。平成30年度の未使用額は次年度分と合わせて，引き続き実施する細胞培養実験および新たに開始する動物実験にあてる予定である。
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