| 研究課題/領域番号 |
18K05525
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| 研究機関 | 東京農業大学 |
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研究代表者 |
中山 勉 東京農業大学, 応用生物科学部, 教授 (50150199)
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| 研究分担者 |
奈良井 朝子 日本獣医生命科学大学, 応用生命科学部, 准教授 (00339475)
植草 義徳 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 助教 (30753024)
飯嶋 益巳 東京農業大学, 応用生物科学部, 准教授 (40390728)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ポリフェノール / テアフラビン類 / 紅茶 / リン脂質膜 / NMR / 胆汁酸ミセル / AFM / 脂質膜二重層 |
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| 研究実績の概要 |
口腔・胃・腸管上皮細胞における細胞膜のモデルとして、ホスファチジルコリン（PC）などのリン脂質から構成されるリポソームに、紅茶の赤色色素であるテアフラビン類(TF1, TF2A, TF2B, TF3)を作用させると、いずれのテアフラビン類もPCとともに不溶性沈殿を形成することを明らかにした。次に胆汁酸を添加したミセル化条件で、TF2A特異的に胆汁酸の界面活性に抵抗性をもつ強力な相互作用を観察した。そこで、TF2AとTF2Bというモノガレート型TF類について、TF類の結合量、局在位置（親水性表面か、疎水性内部か）、さらに脂質集合体の相変化（二重層、ミセル、沈殿）や物性変化（膜構造の破壊による内部水相の漏出などを解析し、ガロイル基の数や結合位置などとの構造活性相関を調べることを試みた。
テアフラビン類とリン脂質膜との分子間相互作用の詳細を解明するために、まず2種類のリン脂質から構成されるモデルリン脂質二重膜（等方的バイセル膜）にTF1を作用させて1H NMRを測定し、各NMRシグナルの帰属を行った。水溶液中およびバイセル膜中で取得したTF1の化学シフト値を比較したところ、ベンゾトロポロン環に由来する水素の化学シフト値変化量が顕著に大きかった。さらに核オーバーハウザー効果（NOE）測定において、TF1のA環およびベンゾトロポロン環の水素とリン脂質の極性基近傍付近の水素との間でNOE相関が観測された。以上の結果から、TF1はリン脂質膜の表面付近と相互作用することが明らかとなった。これはカテキン類（ECg）と等方的バイセル膜との相互作用を1H NMRにて解析した時に得られた結果と共通している。
リン脂質膜二重層にテアフラビン類を作用させた時に生じる脂質膜の構造変化を可視化するため、原子間力顕微鏡（AFM）による解析を目的とした条件検討を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究代表者の中山は、本研究のスタート時である昨年の４月に現在の東京農業大学に異動した。機器類の整備に時間がかかったため、出だしが遅れたが、その後HPLCなどの機器を設置し、現在それらを使って、テアフラビン類の分配係数などを解析できる状態になった。また、研究分担者の飯嶋も同時期に東京農業大学に異動し、その後、AFMによる解析ができる状態になった。
研究分担者の奈良井はPCリポソームならびにミセル構造の微細な変化を検出するために、PC膜表面に蛍光基質（ジフェニルヘキサトリエン（DPH））を挿入し、TF類を作用した時の蛍光偏光解消測定を試みた。しかし、本研究で用いているsmall unilamellar vesicle(SUV)では蛍光基質の偏光特性を十分に得られず、初期蛍光偏光の安定条件を確立するまでに至らなかった。multi-lamellar vesicleでは表面に露出するPC濃度の再現性を保証できないため、SUVに最適な蛍光基質を選択、または蛍光基質挿入条件を検討することが今後の課題となった。
研究分担者の植草は水溶液中およびリン脂質膜中におけるTF1のNMR情報を取得することが可能となり、分子間相互作用の構造的基盤が分子レベルで明らかになりつつある。また、他のテアフラビン類についても同様にNMRを用いる解析が進行しており、種類（化学構造）の違いによりリン脂質の化学シフト値変化量に差が生じることを新たに明らかにした。なお、得られた本成果の一部は学会にて既に発表した。
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| 今後の研究の推進方策 |
TF類の分配係数に及ぼす諸因子の影響をHPLC解析により明らかにし、モデル脂質膜にTF類を作用させた時の脂質膜の構造変化をAFMにて解析する。また、柿渋などのテアフラビン類以外の難吸収性ポリフェノールを用いて脂質膜の構造変化に与える影響を解析する。
蛍光偏光解消を利用したリン脂質膜の微細な物性変化を追跡する実験は、条件検討が難航する可能性があるため、TF類とPCリポソームとの相互作用に及ぼす共存物質の影響を調べる実験も手がける。具体的には、紅茶テアフラビン類が口腔から消化管内に存在する条件で共存しうる食品由来のリン脂質やタンパク質との相互作用と、その後の生体膜との吸着脱着（分配）について解析を試みる。
NMR測定を継続するとともに、各TF類で得られた結果を比較し系統的に解析することで、リン脂質膜との相互作用に重要なTF類の化学構造を明らかにする。また、TF類がリン脂質膜のどこ（相互作用部位）にどのような状態（配向・運動）で存在しているのか、さらにはリン脂質膜の構造や運動に対する影響など、相互作用の構造的基盤を分子レベルで明らかにし、生理機能発現機構における初期段階の解明に道筋をつける。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
進捗状況で述べたように、研究代表者の中山と研究分担者の飯嶋は本研究のスタート時（昨年４月）に現在の東京農業大学に異動した。そこで分析機器の設置に時間と経費を費やし、現在、研究に取り掛かり始めたところである。研究分担者の奈良井（日本獣医生命科学大学）と植草（慶應義塾大学薬学部）において、それぞれ独立した研究項目は順調に進展しているが、研究代表者の実験結果を踏まえて進めることを計画していた項目はこれから始める予定である。これらの諸事情から、「次年度使用」が生じた。したがって本年度は当初の計画に追いつくために、二か年度分を合わせて使用していく予定である。
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