| 研究課題/領域番号 |
18K05552
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
杉本 健吉 新潟大学, 自然科学系, 准教授 (20240765)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | CD41陽性微粒子 / マイクロRNA |
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| 研究実績の概要 |
・両生類，および鳥類の栓球細胞が産生する微粒子の存在を多角的な方法で証明しようと試みた。先ず，抗体の特異性を示すために，申請者がクローニングしたアマガエルインテグリンα鎖（CD41），およびGeneBankに登録してあるニワトリCD41のペプチド断片に対するポリクロ-ナル抗体を作成し，これを精製してそれぞれ蛍光標識した抗体を準備した。この抗体を用いて，両生類栓球細胞，鳥類脾臓細胞から調整した微粒子を染色してフローサイトメータで解析し，これらのペプチド抗体がアイソタイプ抗体に比べて特異的に微粒子を認識することを明らかにした。また，微粒子を精製する方法の1つとして報告されているポリマー粒子を用いて微粒子を精製できるか試験し，これが両生類，および鳥類の微粒子に対しても有効である事が判った。
・両生類および鳥類由来の微粒子が核酸染色試薬で染色されること，および核酸分解酵素処理により蛍光が弱まることをフローサイトメータ-解析により明らかにし，微粒子に核酸が存在することを示した。そこで両生類由来CD41陽性微粒子，鳥類脾臓細胞由来CD41陽性微粒子それぞれから単離したRNAを用いてマイクロアレイ解析を行い，微粒子中のマイクロRNAを同定することができた。
・さらに，両生類微粒子，および鳥類由来微粒子を蛍光標識してこれがマクロファージ細胞株や血管内皮細胞株に取り込まれることを蛍光顕微鏡観察，およびフローサイトメータにより確認した。
・微粒子がこれを取り込むマクロファージの遺伝子発現に対する影響をマイクロチップを用いて解析した。その結果，複数の遺伝子の発現が2倍以上に上昇，あるいは減少していることを見つけた。
・発現が変動している遺伝子のうち，血管新生・阻害・止血などに関連する遺伝子に焦点をあてて解析を進め，複数の遺伝子の発現が確かに変動していることを定量PCRにより確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
・微粒子の存在，およびここに含まれるマイクロRNAを同定出来たこと，およびこの微粒子を受け取ったマクロファージの遺伝子発現が変化したことから，微粒子は遺伝子発現に関する情報を運ぶキャリアーとして機能している可能性を強く示唆することが出来た。
・投稿した論文に関して，微粒子の存在の証明方法が不備であるとの指摘を受けた。この為，さらなる精製方法を組み合わせて微粒子の存在の証明を強固なものにしようと考えている。
・微粒子の機能を明らかにするために，マウスのマクロファージ細胞株を用いたが，両生類微粒子とマウスマクロファージの関係が判らないとの指摘も受けた。両生類はそもそも樹立されている細胞株数が少なく，マクロファージ細胞株も存在しないため，マイクロRNAの機能をFUHEN細胞株以外の両生類細胞株で解明するのは困難であると考えられるため，現在何らかの打開案がないか思案中である。尚，FUHEN細胞はこの微粒子を取り込まないことは確認済みである。一つの方法としてアマガエルを大量に集めて，骨髄細胞にFUHEN細胞由来の微粒子を与えるのが，微粒子の産生細胞とこれを受け取る貪食細胞間でのゲノムが一致するので良いのだが，アマガエルに対応するマイクロアレイは存在しないので，変動する遺伝子を見つけるのが困難である。何らかの良い打開案を考案中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
・微粒子の存在に関しては，さらに超遠心法を取り入れての解析方法も導入し，存在の証拠を積み重ねていくとともに，高率の良い精製方法を確立していく予定である。
・両生類，あるいは鳥類の微粒子が哺乳類のマクロファージ細胞株の遺伝子発現を変化させたことは意義のある事であるが，実際の微粒子を産生する動物に於ける遺伝子の発現を確認する作業があると考えられる。しかしながら，栓球細胞株を樹立した動物（アマガエル）のマクロファージ細胞株や，ニワトリのマクロファージ細胞株は樹立されていない。これらを工夫してin vivoの実験を行う可能性を検討する。
・ニワトリでは，有精卵を使用する事により初期胚における血管新生を観察することが出来る。そこで特定されたマイクロRNAを初期胚において発現させて，血管新生に対してどのような効果が認められるか検討することを計画している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた理由は，使用する消耗品費で使用する試薬などをキャンペーン品などで購入したため，差額が生じた。この金額については，次年度の消耗品費に充てる予定です。
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