| 研究課題/領域番号 |
18K05597
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
東江 栄 九州大学, 農学研究院, 教授 (50304879)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | アイスプラント / CAM型光合成 / 形質転換体 / ストレス耐性 / 生物時計 |
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| 研究実績の概要 |
CAM関連遺伝子の発現を制御するシスエレメント配列を同定するために，他種で見いだされた乾燥による光合成変換に関与する転写調節因子20種の中から，塩によって発現が誘導され，かつCAM型遺伝子と同様な発現の日変化を示す5種の転写調節因子遺伝子をアイスプラントから単離した．既報の情報から特性（ABA応答性，塩反応性，時計遺伝子，及び概日リズムへの関連性）を検証し，MYB96及びHB7の二つに候補を絞った．さらにこれらの結合部位が，アイスプラントのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPC）及びPEPCキナーゼ（PPCK）遺伝子の転写開始点上流領域にあることを明らかにした．これら転写調節因子のCAM遺伝子（McPpc1及びMcPpck）への関与を調べるために，転写調節因子の発現量をRNA干渉（RNAi）で抑制し，CAMのプロモーターの発現量を調査することとし，RNAiの標的配列を決定した．また，一過的発現解析を行うために，アグロバクテリウムインフィルトレーション法を適用することとし，導入ベクターの構築を試みた．
McPpc1及びMcPpckをC3植物であるシロイヌナズナに導入し，いずれも野生株より顕著に高く発現する形質転換体を得た．発現量は，PEPCはアイスプラントの約30％程度，PPCKはアイスプラントの約2倍であった．しかし，PEPCの活性は非形質転換体と同定度であった．ベクターに問題があると考えられたので，McPpc1，McPpck，及びNADPリンゴ酸酵素（Mod1）のプロモーター領域及び翻訳領域を含むゲノム遺伝子，及びMcPpc1のcDNAにMcPpc1のプロモーター，及びMPpckのcDNAにMPpckのプロモーターを連結したDNA断片を含むベクターを作成した．さらに，McPpck及びMcPpc1をもつイネ導入用ベクターを作成した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は，CAM関連遺伝子の発現を制御するシスエレメント配列及び転写因子を同定し，この知見を基に，C3植物にCAM制御因子を導入し，組み替え体にCAMの駆動させることを目的とした．CAM関連遺伝子の発現を制御するシスエレメント配列を同定するために，CAM遺伝子（PEPC及びPPCK）の転写開始点上流に，転写調節因子の結合部位の有無を確認するとともに転写調節因子の機能を推定した．これらの転写調節因子のCAM遺伝子の発現に対する直接的な関与をRNAiで検証するためにRNAi用のベクターのコンストラクトを設計した．また，一過的発現解析を行うアグロバクテリウムインフィルトレーション法用のコンストラクトを設計した．これとは別に，アイスプラントのPEPC及びPEPCK遺伝子を導入したシロイヌナズナを作出した．両遺伝子とも野生型ではほとんど発現量が検出できなかったが，形質転換体では両遺伝子とも夜間に高く発現することを確認した．PEPCはアイスプラントの約30％程度，PPCKはアイスプラントの約2倍高く発現した．しかし，PEPCの活性は非形質転換体と同定度であった．ベクターに問題があると考えられたので，CAM遺伝子のゲノムDNAを含むベクターを作成した．さらに，McPpck及びMcPpc1をもつイネ導入用ベクターを作成した．このように，C3からCAMへの光合成の変換及びCAMの日変化を制御する転写調節因子の候補を絞ることができた．次年度行うRNAi解析で確定することができると期待される．計画通りにCAMの遺伝子を高発現する形質転換体は得られたが，導入酵素の活性は上昇しなかった．この問題を解決するために，新たにベクターを数種構築した．一過的発現解析の手法も刷新し，転写調節因子の同定をより直接的に行える新しい手法を導入するための準備も整った．以上を勘案してほぼ予定通りであると判断した．
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| 今後の研究の推進方策 |
CAM型遺伝子を導入したC3形質転換体を作出するために，プラスミドベクターを用いて目的遺伝子をランダムに導入する方法（従来法）及びゲノム上の目的部位を編集する方法（編集法）を用いる．従来法で作出したアイスプラントのPEPC及びPEPCK遺伝子をもつシロイヌナズナでは，両遺伝子とも夜間に高く発現していたが，PEPC活性は増加しなかった．この問題を改善するために，新規に構築したベクターをシロイヌナズナに導入する．また，CAM遺伝子を組み込んだ高発現ベクターをイネに導入する．ゲノム編集法ではまず編集部位を確定する．イネ及びシロイヌナズナのもつCAM遺伝子の転写開始点上流領域の塩基配列情報をアイスプラントのゲノム情報と比較する．C3植物にはなくCAM植物にはあり，かつ時計遺伝子の制御化で夜間に発現を誘導するシスエレメントを同定する．編集を行うための最適条件を決定しこの領域を編集する．
CAMの誘導及び日変化を制御している転写調節因子を同定するために，候補と考えられる転写調節因子の発現量をRNAiで抑制し，CAM遺伝子のプロモーター活性を調査する．そのために使用するRNAi用ベクターを構築する．一過的発現解析を行うために，クロロプラスト法よりも簡便なアグロバクテリウムインフィルトレーション法を適用する．そのための導入ベクターを構築し，条件設定を行う．さらに，DMS-seq法による転写制御因子の同定を行う．DMS-seq法は，ジメチル硫酸（DMS）でメチル化したDNAをメチル化部位で切断し塩基配列を決定する方法で，タンパク質（転写調節因子）が結合した部位は切断されないことを利用してDNA上のタンパク質の相互作用部位を同定する．本法を用いて，CAM遺伝子の転写開始点上流領域に結合するタンパク質の結合部位を同定する．また結合部位の塩基配列から転写調節因子を推定する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
かねてよりコストパフォーマンスを念頭に置いた研究を心がけているが，今年度は特に費用を効率的に使用することができた．具体的には，実験方法を細かく見直し，無駄な反復や，すでにとってあるデータの過度な確認実験の回数を減らし，重複の回数を抑えた．プラスチック容器などを可能な範囲で繰り返し使うことにより使用量を減らすことで，経費の無駄使いを抑えた．実験者の経験値もあがり，実験の失敗も少なくなったため，無駄な費用を抑えることができた要因と考えられる．さらに，実験者間の情報の共有をすすめた結果，トライ＆エラーの回数も抑えられ，無駄な実験が減った．今後も工夫を重ね経費節減しながた実験の効率化をすすめたい．具体的には，試薬類，プラスチック器具類等への消耗品への使用を想定している．
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