| 研究課題/領域番号 |
18K05658
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| 研究機関 | 龍谷大学 |
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研究代表者 |
奥野 哲郎 龍谷大学, 農学部, 教授 (00221151)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 殺菌剤 / フェリムゾン / 作用機作 / 薬剤耐性 / ウリ類炭疽病菌 / イネいもち病菌 / 静菌的防除剤 / 銅トランスポーター |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、未だ圃場耐性菌の報告のない静菌的作用を示す殺菌剤フェリムゾンの作用機作を明らかにし、耐性菌が出現しない新規薬剤開発のためのターゲットを明らかにすることである。本研究ではアグロバクテリウム形質転換法を用い、ハイグロマイシン耐性を指標にT-DNA挿入変異株を作出して、フェリムゾン感受性が低下した株の遺伝子を同定し、それらの遺伝子機能と薬剤耐性の関係を明らかにする。初年度は、耐性候補株としてリストアップされたウリ類炭疽病菌2５菌株中１１株について詳細な解析を行った。１１の候補菌株は菌糸コロニーでの色素生成、胞子形成、付着器形成など病原性発現において重要ないずれかの性質が欠損していた。そのうちAPSESファミリーに属する転写因子CoSTUAの欠損株(デルタcostuA)とCoSTUA遺伝子のストップコドンの数塩基上流でグアニン塩基が１つ欠失していたCoSTUA(-G)c株（実験中に偶然得られた薬剤耐性のみ保持した株）と野性株の３株から全RNAを抽出しトランスクプトーム解析（RNAseq）を行った。その結果、デルタcostuAとCoSTUA(-G)cで共通して発現量が減少あるいは増加し、両株間での発現量には有意な差はなく、野性株との比較では発現量に有意な差が認められる多数の遺伝子をフェリムゾン感受性関連候補遺伝子としてリストアップすることができた。
また、候補遺伝子の１つである銅輸送に関わるCoICT1遺伝子の破壊株とそれと関連する銅シャペロンCoCCC2遺伝子の破壊株がフェリムゾン感受性低下を示したことから、銅輸送系がウリ類炭疽病菌とイネいもち病菌のフェリムゾン感受性に関わることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ハイグロマイシン耐性を指標に得られたT-DNA挿入変異株約7000株のスクリーニングからAPSESファミリーに属する転写因子CoSTUAと銅輸送に関わるCoICT1をフェリムゾン感受性関連因子として同定できた。さらにCoICT1の関係因子として銅シャペロンCoCCC2の欠失もフェリムゾン感受性を低下させたことから、銅輸送系がフェリムゾン感受性に関わることが明らかになった。
デルタcostuAとCoSTUA(-G)cのRNAseq解析で共通して発現量が減少あるいは増加し、また、両株間での発現量には有意な差はなく、野性株との比較では発現量に有意な差が認められる多数の遺伝子をフェリムゾン感受性関連候補遺伝子としてリストアップすることができた。
CoSTUA株とCoICT1株以外のフェリムゾン耐性候補ウリ類炭疽病菌株９株中８株については候補遺伝子をハイグロマイシン遺伝子と置換した破壊株作成に成功し、候補遺伝子とフェリムゾン耐性、および病原性発現の関係を調べた。ただし、候補遺伝子を破壊したいずれの株もフェリムゾン耐性を示さなかった。考えられる原因としては, T-DNA挿入遺伝子以外の遺伝子で変異が起きたセクター株をフェリムゾン培地上で選抜した可能性、あるいはT-DNA挿入がフェリムゾン感受性低下に関わる他の遺伝子の発現に影響を及ぼした可能性が考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでと同様、ハイグロマイシン耐性を指標にT-DNA挿入変異株を作出して、フェリムゾン感受性が低下した株をできるだけ多く取得し、候補遺伝子のフェリムゾン感受性と菌の病原性の関係とそれらの機能を調べる。
銅輸送系がフェリムゾン感受性に関わることが明らかになったことから、細胞膜に存在すると考えられる銅のリセプターをコードするCTR1遺伝子に着目し、CTR1とその関連遺伝子の破壊株を作成し、フェリムゾン感受性と病原性について調べる。
デルタcostuAとCoSTUA(-G)c のRNAseq解析で共通して発現量が減少する、あるいは増加する遺伝子から銅輸送、あるいは銅依存タンパク質に関連すると考えられる遺伝子を選抜し解析する。
ウリ類炭疽病菌104-T株で効率よく良くT-DNA挿入菌株を作出できる系を確立できたが、イネいもち病菌での効率的な形質転換系がまだ完成していないのでその系を完成させる。
イネいもち病菌ではフェリムゾン処理により電解質の漏出、培地の酸性化の促進など膜機能への影響が明らかにされている。また、胞子は発芽し数細胞まで分裂しそこで菌糸生育が静止する。それらの事象と関連する事象として、フェリムゾンのエンドサイトシスへの影響や菌糸生育で重要な役割を担うと考えられる活性酸素種の生成あるいは除去などの制御に直接あるいは間接的に関わる因子の解析を進める。
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