哺乳類卵子・初期胚の常温長期保存に関する研究～遺伝資源保存への適用を目指して～

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K05691
• 研究機関: 順天堂大学
• 研究代表者: 多田 昇弘 順天堂大学, 大学院医学研究科, 先任准教授 (50338315)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: マウス / 卵子 / 初期胚 / 真空乾燥 / 室温保存 / トレハロース / CRISPR/Cas9 / バイオリソース

研究実績の概要

本研究では、液体窒素を用いない保存方法、即ち、卵子及び受精卵（初期胚）の保存に有効な真空乾燥・室温保存法を開発することを目的とする。
本研究では、室温保存における乾燥保護物質としてトレハロースに着目し、トレハロースを含む保存液を用いて、種々の条件下でマウス卵子・初期胚について真空乾燥後、室温保存を行い、復水後の生存性を確認することとした。まず、細胞膜でトレハローストランスポーターを発現するノックインマウスのゲノム編集による作製を試み、4匹についてシークエンス解析を行い、ドナーベクター(CAG-PvTRET1-IRES2-AcGFP; CTIG)のノックインの状態を確認した。その結果、2匹にRosa26 locusのセーフハーバー領域にCTIGがインタクトの状態で挿入されていることがわかった。これらのマウスラインについて繁殖を行い、F2世代のホモ個体を得た後、採卵を行い、受精卵（1-細胞期卵）におけるGFP発現の有無を確認したところ、微弱な発現を示す受精卵しか得られなかった。また、トレハロースを含むTris-EGTAにノックインマウスより採取した初期胚（2-細胞期胚）を浸漬し、デシケーター内で真空乾燥・室温保存後の生存性を確認したところ、すべての胚で形態的な異常が認められ、胚発生は確認できなかった。
一方、電気穿孔法（エレクトロポレーション）による初期胚へのトレハロース取り込みについては、ローダミンデキストランを用いて決めた最適なエレクトロポレーションの条件下で初期胚（2-細胞期胚）を用いて、実際に、ローダミンデキストラン/トレハロースを含む緩衝液中でエレクトロポレーションを行った。その結果、ローダミンデキストランの細胞内取り込みによる蛍光を発する2－細胞期胚が得らたが、これらの胚について、真空乾燥・室温保存を行ったところ、復水後、回収されたすべて胚で生存は認められなかった。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

トレハローストランスポーター（PvTret1）を細胞膜上で発現することが期待できるノックインマウス(Rosa26-CTIG-KIマウス)が2匹（ライン）作製できた。これら2ラインについて繁殖を行い、ホモ個体の作出を試みた。しかし、出産しても食殺が頻繁に起こり、予定よりもホモ作出が遅れてしまった。現在もホモ個体を取得中である。また、例数は少ないが、ホモ個体より得られた受精卵について蛍光顕微鏡下でGFPの発現を確認したが、今のところ、微弱なGFP発現を示す受精卵しか得られていない。更に、これらのホモ個体由来初期胚（2-細胞期胚）をトレハロースを含む保存液（Tris-EGTA）に浸漬してデシケーター内で真空乾燥・室温保存を行ったが、復水後の生存胚は得られなかった。実験に使用できる十分なホモ個体が得られていないので、ホモ個体由来の初期胚の使用が限られたため、初期胚の発生ステージ、保存液(トレハロースを至適濃度を含む)、真空乾燥、室温保存及び保存期間の最適な条件を決めることができなかった。
一方、電気穿孔法（エレクトロポレーション）による初期胚へのトレハロースの取り込みの試みについては、ローダミンデキストランを用いて、種々の条件下でエレクトロポレーションを行い、初期胚（2-細胞期胚）への取り込みに対する最適な条件を決めることができた。次いで、ローダミンデキストラン及びトレハロースを含む緩衝液（Tris-EGTA）中にマウス2－細胞期胚を浸漬後、パルスをかけ、電気穿孔によるローダミンデキストラン/トレハロースの細胞への取り込みを確認した。その後、取り込みが確認できた2-細胞期胚は、トレハロースを含む保存液中に移した後、デシケーター内で真空乾燥・室温保存をさせたが、復水後の胚の生存は認められなかった。初期胚の発生ステージ、緩衝液、真空乾燥及び室温保存の最適な条件を検討する必要がある。

今後の研究の推進方策

Rosa26-CTIG-KIマウスのホモ個体由来初期胚を用いて、発生ステージ（1-細胞期卵、2-細胞期胚、8-細胞期胚、桑実期胚、胚盤胞）、保存液（トレハロース、エピカテキン、アスコルビン酸を種々の濃度で含むTris-EGTA, PB1, M2, mCZB-hepes）、真空乾燥（乾燥時間、乾燥温度）及び室温保存（温度、湿度、保存期間）について条件検討を行い、室温保存後、初期胚が生存できるような至適条件を見出す。真空乾燥・室温保存後、生存している胚が得られた場合は、偽妊娠を誘起したレシピエントマウスの卵管または子宮に胚を移植することにより産仔を得て、発生能及び正常性を確認する。正常な産仔が得られた場合は、離乳後、繁殖を行い、妊孕性及び正常な子孫が得られることを確認する。
一方、電気穿孔によって初期胚にローダミンデキストランが取り込まれることが確認できたので、今年度も、引き続き、ローダミンデキストランと共にトレハロースを電気穿孔により取り込ませた初期胚について、発生ステージ毎に、真空乾燥・室温保存を行い、復水後の生存性及び発生能を確認する。その際、前述したような保存液、真空乾燥・室温保存の至適な条件を各々決定する。また、真空乾燥・室温保存後、生存胚が得られた場合は、胚移植を行い、発生能及び正常性を確認する。
更に、マウス1-細胞期卵の細胞質にトレハロース/ローダミンデキストランを顕微注入した後、１日培養して2-細胞期胚に発生させた後、これらの胚について種々の条件下で真空乾燥・室温保存を行い、復水後の胚の生存性を確認する。
これらの方法によっても初期胚の真空乾燥・室温保存が不可能な場合は、核の正常性を確認するために、脱核した未受精卵に真空乾燥・室温保存した初期胚由来の核を移入し、これらの卵を培養して胚盤胞への発生を確認すると共に、移植することにより胚発生の正常性を確認する。

次年度使用額が生じた理由

（理由）物品費として、マイクロチューブ、チップ、カルチャーディッシュ、マイクロインジェクション用ピペット用ガラス管、胚操作用ガラス管、PCRキット、プライマー、試薬（トレハロース、Tris-EGTA、ローダミンデキストラン、M2, PB1, エピカテキン、アスコルビン酸）、培養液（mCZB-hepes、CARD medium、Fertiup、Modified Whitten's Medium）、並びに動物代（マウス）に支出したが、ノックインマウスのシークエンス解析及びホモ個体作出のための繁殖に長期間を要したため、実験が予定通り遂行できなかった。
（使用計画）物品費として、マウスの飼育料、シークエンス解析利用料、マイクロチューブ、チップ、カルチャーディッシュ、PCRキット、試薬（トレハロース、Tris-EGTA、ローダミンデキストラン、M2, PB1, エピカテキン、アスコルビン酸、性腺刺激ホルモン；PMSG, hCG、流動パラフィン）、培養液・緩衝液（CARD medium、Fertiup、Modified Whitten's Medium、PB1, M2, mCZB-hepes, エレクトロポレーション用緩衝液）、動物代（マウス）などの購入に充てる。また、得られた研究成果は、日本実験動物学会等に発表する予定なので、その際は、学会参加費、宿泊費及び交通費等に充てる。

研究成果

• [雑誌論文] Interleukin-11-expressing fibroblasts have a unique gene signature correlated with poor prognosis of colorectal cancer. (2021)
  • 著者名/発表者名: T. Nishina, Y. Deguchi, D. Ohshima, W. Takeda, M. Ohtsuka, S. Shichino, S. Ueha, S. Yamazaki, M. Kawauchi, E. Nakamura, C. Nishiyama, Y. Kojima, S. Adachi-Akahane, M. Hasegawa, M. Nakayama, M. Oshima, H. Yagita, K. Shibuya, T. Mikami, N. Inohara, K. Matsushima, N. Tada, H. Nakano
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 12(1) ページ: 2281
  • DOI: 10.1038/s41467-021-22450-3
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ablation of fatty acid desaturase 2 (FADS2) exacerbates hepatic triacylglycerol and cholesterol accumulation in polyunsaturated fatty acid-depleted mice. (2021)
  • 著者名/発表者名: Y. Hayashi, H-C. Lee-Okada, E. Nakamura, N. Tada, T. Yokomizo, Y. Fujiwara, I. Ichi.
  • 雑誌名: FEBS Letters 巻: 595 ページ: 1920-1932
  • DOI: 10.1002/1873-3468.14134.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Homeostatic p62 levels and inclusion body formation in CHCHD2 knockout mice. (2021)
  • 著者名/発表者名: S. Sato, S. Noda, S. Torii, T. Amo, A. Ikeda, M. Funayama, J. Yamaguchi, T. Fukuda, H. Kondo, N. Tada, S. Arakawa, M. Watanabe, Y. Uchiyama, S. Shimizu, N. Hattori
  • 雑誌名: Human Molecular Genetics 巻: 30 ページ: 443-453
  • DOI: 10.1093/hmg/ddab057
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ependymal ciliary motion and their role in congenital hydrocephalus. (2021)
  • 著者名/発表者名: K. Sakamoto, M. Nakajima, K. Kawamura, E. Nakamura, N. Tada, A. Kondo, H. Arai, M. Miyajima
  • 雑誌名: Child's Nervous System 巻: 37(11) ページ: 3355-3364
  • DOI: 10.1007/s00381-021-05194-9
  • 査読あり
• [学会発表] C57BL/6マウスにおける加齢に伴う運動機能とドーパミン作動性ニューロンの変性 (2021)
  • 著者名/発表者名: 野田幸子、佐藤栄人、福田隆浩、多田昇弘、服部信孝
  • 学会等名: 第68回日本実験動物学会総会（Web開催）
• [学会発表] 水頭症を発症する微小管モーター蛋白質ダイニンDnah5欠損マウスの病態解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 中村衣里、荻野郁子、川村海渡、阪本浩一朗、中島円、宮原克、多田昇弘、宮嶋雅一
  • 学会等名: 第68回日本実験動物学会総会（Web開催）
• [学会発表] CHCHD2欠損パーキンソン病モデルマウスの解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 佐藤栄人、野田幸子、多田昇弘、服部信孝
  • 学会等名: 第68回日本実験動物学会総会（Web開催）