| 研究課題/領域番号 |
18K05760
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
粟野 達也 京都大学, 農学研究科, 助教 (40324660)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 放射柔細胞 / 接触細胞 / 隔離細胞 / プロテクティブレイヤー / ラムノガラクツロナンI / 網羅的免疫標識 |
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| 研究実績の概要 |
広葉樹材の放射柔細胞は他の構成要素とは異なる機能を有しており、細胞壁の構造や組成が異なる。リグニンおよび多糖類分布の報告はあるが、非セルロース性多糖類や糖タンパク質の分布は明らかではない。そこで、38種のモノクローナル抗体を用いた免疫金標識・透過電子顕微鏡法によりポプラ放射柔細胞壁での非セルロース性多糖類の分布を観察した。
その結果，ペクチンに関しては、アラビナン、アラビノガラクタンおよびラムノガラクツロナンIの標識が細胞壁最内層と壁孔膜に見られた。細胞壁最内層におけるペクチンおよび糖タンパク質は接触細胞に存在するプロテクティブレイヤーと関係があると考えられる。ヘミセルロースに関しては、キシラン、マンナンの標識が二次壁で見られた。一方、キシログルカンの標識は複合細胞間層と壁孔膜部に見られた。ヘミセルロースの標識は放射柔細胞間で違いがなかった。
ヘミセルロース標識の分布は木部繊維と共通しているが、ペクチンおよび糖タンパク質標識の分布は木部繊維と異なっており、ペクチンおよび糖タンパク質は放射柔細胞の機能と何か関係があると考えられる。
放射柔細胞には道管要素と壁孔を介した連絡を持つ接触細胞と連絡を持たない隔離細胞があるが、隔離細胞にはラムノガラクツロナンIの標識がみられる細胞と見られない細胞があることを見出した。これらは放射組織内での配置が異なり、標識が見られる隔離細胞は放射組織の上下端の2－3列に、標識が見られない隔離細胞は放射組織の中央部に存在することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
免疫金標識・透過電子顕微鏡法で広葉樹材の放射柔細胞における非セルロース性多糖類および糖タンパク質の免疫局在を網羅的に観察した。その結果、ヘミセルロース標識の分布は木部繊維と共通しているが、ペクチンおよび糖タンパク質標識の分布は木部繊維と異なっていることが明らかとなり、ペクチンおよび糖タンパク質は放射柔細胞の機能と何か関係があると考察した。
放射柔細胞には道管要素と壁孔を介した連絡を持つ接触細胞と連絡を持たない隔離細胞があるが、ラムノガラクツロナンIの標識がみられる隔離細胞と見られない隔離細胞があり、標識が見られる隔離細胞は放射組織の上下端の2－3列に、標識が見られない隔離細胞は放射組織の中央部に存在することが明らかとなった。このことは、細胞形態ではなく非セルロース性多糖類の分布様式により細胞の区分ができることを示しており、当初の期待通り免疫標識法による細胞の区別ができることを示した。
汎用の96穴マイクロプレートに円形カバーガラスを落とし込み，通常のELISA法と同様に免疫標識を行うことを検討した。直径5mmの切片剥離防止処理（MASコート）カバーガラスを特注で設計し、マイクロプレートウォッシャーで問題なく使用できることを確認した。しかし、新型コロナ感染症による実験停止により十分な実験時間を確保できなかったため、免疫標識の再現性を確認するには至らなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初計画では、スライドガラス4枚を96穴マクロプレートシステムで使用するためのアダプタを作製する予定であったが、96穴プレートでは液漏れが発生し、免疫標識に使用することができなかった。そのため、切片剥離防止処理を施した直径5mmのカバーガラスを作製し，汎用の96穴マルチプレートに落とし込んで通常のELISA法と同様に免疫標識を行い、プレートウォッシャー等が問題なく利用できることを確認した。引き続き、免疫標識の再現性を確認したのち、網羅的免疫標識を試みる。
放射柔細胞における非セルロース性多糖類および糖タンパク質の免疫標識の結果、蛍光顕微鏡での蛍光標識の局在と電子顕微鏡での金コロイド標識の局在が異なる場合があった。これは蛍光標識二次抗体と金コロイド標識二次抗体のサイズの違いに起因する可能性がある。金標識二次抗体のサイズを極力蛍光標識二次抗体のサイズに近づけるため、ナノゴールド（1.4nmの金粒子）標識二次抗体の利用を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナ感染症により実験停止期間が生じ、十分な回数免疫標識実験を行うことができなかった。またそれに伴い、使用予定であった抗体試薬の購入を見合わせたため、次年度使用額が生じた。
次年度使用額は、抗体試薬の購入、カバーガラスの特注作製費用に充てる。
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