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本研究では、実質的な性決定因子がエストロゲンであることが分かったカンパチを用いて、エストロゲンにより直接活性化される初期性分化関連遺伝子を同定することを目的として、多検体mRNA-seq法の立ち上げと、それを用いて初期性分化時期の詳細な遺伝子発現解析を行った。
昨年度までに、BRB-seq法により安価に多検体から3'end mRNA-seqライブラリ調整が可能なことを示した。しかし、未分化生殖腺のように微量のtotal RNAしか回収できない場合、作製したライブラリの濃度が極端に低いなど、BRB-seq法では困難を伴うことが分かった。また、BRB-seq法ではtransposomeの自作が必要で、技術的に簡便とは言い難い点もあった。そこで今年度は、昨年度のBRB-seqデータのさらなる解析を進めるとともに、transposomeが必要なく、かつ微量RNAでも簡便にライブラリ調整が可能な方法を模索した。
検討の結果、1st strand cDNA合成を行う際に熱処理でRNAを断片化し、そこからライブラリ調整を行う方法を用いれば、transposomeを使う必要もなく、かつ十分な濃度のライブラリも作製でき、BRB-seq法よりもはるかに簡便にライブラリ調整ができることが分かった。この方法を用いて、少数検体でシーケンシング・解析を行った結果、BRB-seqと遜色ない結果が得られた。
また、昨年度までにBRB-seqで得たシーケンスデータのさらなる解析を進めたところ、カンパチで分子的性分化が始まる時期を１週間程度の幅まで狭めることができた。この時期の発現変動遺伝子は100遺伝子にも満たず、これらの遺伝子がエストロゲンに直接活性化される初期性分化遺伝子であることが示唆された。
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