| 研究課題/領域番号 |
18K05797
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| 研究機関 | 龍谷大学 |
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研究代表者 |
吉山 洋子 龍谷大学, 農学部, 実験助手 (80519968)
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| 研究分担者 |
吉山 浩平 滋賀県立大学, 環境科学部, 准教授 (90402750)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | シアノバクテリア / 湖沼生態系 / 生物時計 |
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| 研究実績の概要 |
生物のもつ約24時間の内生リズムを生み出すシステムを概日時計とよぶ．これまでの概日時計研究は原核生物のシアノバクテリアで特によく進んでいるが，その仕組みの解明に主眼が置かれ，生態系での適応的意義に関する研究は進んでいなかった．自然生態系では近年研究が始まったばかりで，海洋性シアノバクテリアの多くが概日リズムを持つことが明らかになっているが，研究の中心は海洋で，淡水域では殆ど調べられていない．そこで本研究では，淡水域を中心に「シアノバクテリア生物時計の，水域生態系における適応的意義を野外調査（テーマ１）及び実験室（テーマ２）において検証する」ことを目的に進めている. 1年目となる昨年度は，主にテーマ１の野外調査を行い，シアノバクテリアの単離を行った.
テーマ1（野外調査）. 淡水域生態系におけるシアノバクテリア時計遺伝子保持の検証：昨年度の野外調査（採水）は，琵琶湖北湖および南湖の複数深度で行い，シアノバクテリアの単離を行なった．全く単離の出来ない時期もあったが，年間を通じて，20種類を超える藻類が採取できた．今年度も引き続き，野外調査により新規株の単離を継続する．今年度は，昨年度得た株の時計遺伝子の解析を行う．
テーマ2（室内実験）. シアノバクテリア体内時計の適応的意義の実験的検証：野外でも「内生リズムと環境サイクルの一致が生存を有利にさせる」ことが予測される．そこで，野外調査により得られた株で，昼夜リズムと生理活性（増殖速度と光合成活性）の関係を明らかにする．昨年度は，実験室で光合成速度測定システムの構築を行った．今年度は，本システムと，昨年度得られた株を用いて，複数の明暗周期下で培養を行い，生理活性指標（増殖速度，光合成活性）を最大化する周期を調べ，各株の内生リズムや，実際の出現時期の昼夜パターンとの比較を行う．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1年目となる昨年度は，主に琵琶湖の野外調査を行い，シアノバクテリアの単離を行った（テーマ１）.また，実験室においては光合成速度測定のためのシステム構築を行った（テーマ2）．
テーマ１の野外調査は，代表者の過去の研究結果を元に，琵琶湖北湖表水層および南湖において，表水層，クロロフィルピーク，水温躍層，深水層等で採水を行った．水質プロファイラーによりリアルタイムで測定した環境データを元に，状況に応じて，採水点は増減させた．持ち帰った試水は，フィルターにより捕食者を取り除き，吸引濾過によって湖水を濃縮した後，シアノバクテリア用培地に濾水をプレートに接種し，培養を行った．得られたプレートを複数回植え継ぐことで藻類の単離を行なった．得られた藻類は，顕微鏡により確認を行った．調査は様々な日長に適応した藻類を得るため１回/月以上の頻度で行った． 全く単離の出来ない時期もあったが，昨年度は年間を通じて，20種類を超える藻類を採取することができた．
テーマ２では実験室において，主に光合成速度測定のためのシステムの構築を行った．本実験では，非接触型の溶存酸素センサーとして，タイテックFibox4-Traceを用いる予定であったが，研究費の減額により該当機種が購入できなかったため，同等仕様相当のBAS 酸素モニターを購入し，現在，光合成活性測定方法について検討している．
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| 今後の研究の推進方策 |
・テーマ１（野外調査）淡水域生態系におけるシアノバクテリア時計遺伝子保持の検証：今年度も引き続き，野外調査により新規淡水性シアノバクテリアの単離を継続する．また今年度は，昨年度得られた株を用いて，時計遺伝子（kaiA, kaiB, kaiCおよび，その相同遺伝子）の保持の解析を行う．これらの結果より，より淡水性シアノバクテリアの時計遺伝子の保有率と時計遺伝子の多様さを明らかにする．海洋に比べ，環境変動の大きい淡水域では，時計遺伝子は生存に必須であり，欠損する種はないと予想している．
・テーマ２（室内実験）シアノバクテリア体内時計の適応的意義の実験的検証：今年度は，昨年度に野外より単離した株を用いて仮説の検証実験を行う，具体的には，現在構築中の培養システムを用い，様々な明暗周期下で培養を行い，生理活性指標（増殖速度，光合成活性）を最大化する周期を調べ，各株の内生リズムや，実際の出現時期の昼夜パターンとの比較を行う．内生リズムは恒明条件下でもリズムが変化しにくい光合成系遺伝子，または時計遺伝子の遺伝子発現解析によって求める．培養実験はOuyang et al.（PNAS 1994）に従い行う．増殖速度測定は，１回/２日，蛍光顕微鏡法により計数し算出する．光合成活性測定は，明暗瓶法を改良して用いる．本操作実験の結果より，シアノバクテリアの内生リズムに対し，明暗周期の変化が各要因に与える影響を解析することで，概日時計がシアノバクテリアの生存競争に与える影響を考察する．本実験の結果は，reproductive fitnessは，各株の出現時期の昼夜パターンと一致した明暗周期において，最大化されると予測される．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年度、溶存酸素濃度の測定（テーマ２）を立ち上げる予定が計画よりも若干遅れ、これに関連する消耗品の購入ができなかったため、使用額に差が生じた。今年度、テーマ２関連の消耗品代にあてる予定である。
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