| 研究課題/領域番号 |
18K05809
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人水産研究・教育機構 |
|---|
研究代表者 |
山崎 康裕 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産大学校, 講師 (40598471)
|
|---|
| 研究分担者 |
紫加田 知幸 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 瀬戸内海区水産研究所, 研究員 (40603048)
内山 郁夫 基礎生物学研究所, ゲノム情報研究室, 助教 (90243089)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | 赤潮 / ヘテロカプサ / 溶血活性 / トランスクリプトーム / 二枚貝へい死 / シオミズツボワムシ |
|---|
| 研究実績の概要 |
渦鞭毛藻 Heterocapsa circularisquama （以降，ヘテロカプサ）は，貝類に極めて強い毒性を発現する赤潮の原因種である。先行研究により，ヘテロカプサの毒素は膜タンパク質であると推定されたが，速やかに失活するため毒素の精製が困難である。そこで本研究では，毒性の異なるヘテロカプサ細胞の各種遺伝子発現量を比較して毒性発現に関わる遺伝子群を見出すとともに，毒素候補の一次配列からエピトープを人工合成・免疫して作製したポリクローナル抗体を用いた免疫学的研究によって本種による貝類へい死機構の解明を目的とした。
ヘテロカプサが産生する毒素候補の選抜を行うために，無菌化した強毒株と弱毒株のトランスクリプトーム解析を実施した。この結果，膜貫通領域を有し，かつ，強毒株で有意に（FDR < 0.01）高く発現している214個の膜タンパク質関連の遺伝子群を見出すことに成功した。また，これらのうち強毒株が有する溶血活性に関連する可能性のある複数の遺伝子群を確認することができた。さらに，シオミズツボワムシを用いたバイオアッセイの結果，無菌化した強毒株の毒性は対数増殖初期より定常期で高くなること，および窒素欠乏状態における毒性の低下が観察された。
一方，次年度以降に予定している毒素候補に対するポリクローナル抗体（以降，抗体）を用いた免疫学的研究を円滑に遂行するために，研究に用いたヘテロカプサ培養株での発現が確認された膜タンパク質であるNADPHオキシダーゼに対する抗体を作製して間接蛍光抗体法の条件検討を行った。この結果，作製した抗体は本種細胞表面に存在すると考えられるNADPHオキシダーゼを認識したことから，トランスクリプトーム解析で得られた配列情報を用いた抗体作製および免疫学的研究の円滑な推進に必要な条件等を確立することができた。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当該年度の研究では，無菌化したヘテロカプサ強毒株と弱毒株のトランスクリプトーム解析により，ヘテロカプサの毒素と推定されている膜タンパク質であり，かつ，強毒株で有意に（FDR < 0.01）発現量が高い214個の遺伝子群を見出すことに成功したため，当初の計画が順調に進展していると判断できる。ただし，当該年度は強毒株と弱毒株をそれぞれ1株しか解析できなかったため，毒素候補遺伝子をさらに絞り込むためには解析検体数を追加する必要があると考えている。また，当該年度は増殖段階や栄養塩欠乏によってヘテロカプサの毒性が変化することを見出したため，このような同一株における毒性変化にも着目してトランスクリプトーム解析の対象として検討を進める必要がある。
一方，ヘテロカプサのトランスクリプトームデータからエピトープを人工合成・免疫し，得られたポリクロ―ナル抗体を用いた間接蛍光抗体法による標的タンパク質の蛍光観察に成功した。よって，次年度は毒素候補として選抜したタンパク質の一次配列情報を用いた抗体作製および免疫学的研究の円滑な推進が大いに期待される。
以上のことから，当該年度はヘテロカプサの毒素本体や作用メカニズムの解明に繋がる基礎的知見が集積できたことから，研究はおおむね当初の計画通りに遂行できたと判断した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
次年度は，さらに毒素候補遺伝子を絞り込むために，複数の強毒株および弱毒株を対象としてトランスクリプトーム解析を実施する予定である。また，当該年度に明らかとなった増殖段階や栄養塩欠乏によるヘテロカプサの毒性変化にも着目し，トランスクリプトーム解析の対象として検討を進める。解決すべき課題として，増殖初期や栄養塩欠乏状態などの低密度の培養液から解析に必要な量と質を維持した状態で細胞を回収することが挙げられる。特に，複数回の遠心分離や濾過濃縮などの操作を多用すると，ヘテロカプサ細胞の損傷が大きいため，次年度は細胞へのダメージが少ない回収方法の検討を行う予定である。
一方，毒素候補タンパク質の一次構造からエピトープを人工合成・免疫して抗体を作製し，ヘテロカプサ細胞における毒素の局在部位や毒素の作用メカニズムについて検討を進める予定である。解決すべき課題として，間接蛍光抗体法の過程で実施する遠心分離（洗浄作業）によるヘテロカプサ細胞へのダメージが挙げられる。当該年度は，作製した抗体が本種細胞表面に存在すると考えられるNADPHオキシダーゼを認識したものの，ヘテロカプサ細胞の多くが遠心分離のダメージにより通常の形態を維持できなかった。よって，次年度は遠心分離による洗浄操作の代替となる方法，もしくは洗浄効果を維持した状態で細胞へのダメージを低減できる遠心分離条件の検討を行う予定である。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）次世代シーケンス解析およびポリクロ―ナル抗体作製の費用が当初の見積額より安価となったことから，当該助成金が生じた。
（使用計画）生じた助成金は，翌年度分として請求した助成金と合わせ，次世代シーケンス解析費用として利用する予定である。
|
