| 研究課題/領域番号 |
18K05824
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
菅 向志郎 長崎大学, 水産・環境科学総合研究科(水産), 教授 (60569185)
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| 研究分担者 |
平坂 勝也 長崎大学, 海洋未来イノベーション機構, 准教授 (70432747)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 魚病細菌 / 仔稚魚 / 生体防御機構 |
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| 研究実績の概要 |
これまで生体防御機構が研究されてきた魚類において、生物餌料を摂餌している仔魚期に免疫システムである自然免疫が機能し始め、稚魚期に移行した後に特定病原因子に応答する獲得免疫が誘導されることが報告されている。
従来、この仔魚から稚魚に至る幼若期は、紫外線殺菌海水などによる環境水に存在する細菌を極力少なくして飼育しているが、この時期の生体防御システムの発達に注目し、細菌に曝露することで抗病性を有した稚魚の飼育を本研究の目的とした。2019年度は、受精卵供給先での親魚の不調により、受精卵の入手ができず計画していた魚種での実験が出来なかった。そこで、通年受精卵が入手可能なキリフィッシュを用いた実験系の構築および、強毒株のホルマリン死菌を用いた摂餌実験の基礎研究を実施した。ホルマリン死菌を用いる場合、菌数を正確に計測する定量PCRによる手法を確立し、シオミズツボワムシに取り込ませる最適な菌濃度について知見の収集が必要である。このため、ホルマリン処理による定量PCRへの影響について、ホルマリン死菌（FKC）と生菌との菌数を比較した。その結果、FKCのCt値は生菌より高い数値となり、また、各菌数とCt値の検量線の傾きはほぼ同じであった。よって、ホルマリン処理により定量PCRの鋳型として機能しないDNAが生じたこと、この割合は菌数にかかわらず一定であることが明らかとなった。定量PCRで計測するFKCの菌数は、ファクターを乗じることで補正が可能となった。Edwardsiella tardaに対するキリフィシュの病原性試験の結果、筋肉注射による攻撃で斃死した。また、攻撃により死亡した個体の脾臓から検出した菌数は、接種菌数より数千から数十万倍高くなった。これらのことから、E. tardaはキリフィッシュに病原性を有し、本魚種が実験に使用可能であることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ヒラメ受精卵は、早期採卵および通常採卵の年2回に入手可能であり、本研究はこの時期に合わせて2回行う予定であった。
しかし、2019年度は、親魚の不良により、 ヒラメでの飼育実験はできなかった。このため、本研究に用いるEdwardsiella tardaのFKCの菌数測定法および新たにキリフィッシュを用いる実験系の構築を行った。FKCの菌数測定では、生菌と同じ菌数での定量PCRのCt値を比較し、菌数とCt値の両検量線は平行であることからファクターを乗じることで算出が可能となった。キリフィッシュについては、E. tardaは病原性を示すことを明らかにした。本種は小型であるため臓器の自己消化が早く進むため斃死したのちホルマリンで固定し、病症などを見るため剖検を行った。斃死個体には、食欲不振、腹部の発赤、脱腸などの症状が見られた。次年度も親魚の不調などにより受精卵の入手が出来ないことが予想されるが、キリフィッシュは研究室内で容易に飼育可能で通年にわたり仔魚が得られる。ヒラメ仔魚を用いた飼育実験の回数は、予定通りに実施出来なかったが、その他の次年度以降の実験に必要な条件などについて、多くの知見が得られた。これらのことから、やや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
2019年度に実施したキリフィッシュへの魚病細菌含有ワムシおよびアルテミアの摂餌実験を継続し、抗病性の付与について検討する。ヒラメ受精卵が入手できれば、同時にヒラメについても同様に実施する。魚病細菌は生菌とFKCを使用する。
攻撃試験は、強毒性を示す魚病細菌株を浸漬もしくは筋肉注射により実施し、生残率および生残日数、病症の進行度について試験区で処理した稚魚の評価を行う。生存個体を得た場合、血漿中の抗体価、脾臓、腎臓における攻撃菌株の細菌数を計測し、詳細な抗病性について解析する。抗病性に関して、腸管免疫は重要であるため、生存個体の腸管組織解析を行い、炎症の有無、貪食細胞の局在や数について組織切片を用いて解析する。十分な生存個体が確保できれば、腹腔内マクロファージを単離し、強毒および弱毒E. tardaを貪食させ、オートファジーに関連する遺伝子発現量解析を試みる。ヒラメ受精卵の入手について懸念があるが、キリフィッシュで実験することで本研究の基礎的知見は十分に得ることが可能である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は、飼育実験を2回実施する予定であったが、入手先の親魚の状態が不良であったため、ヒラメの受精卵が入手出来なかった。このため、飼育実験に使用する試薬類の購入額が減少し使用予定金額より僅かな残額が生じた。次年度は、研究計画に従い実験を進めるだけでなく、ホルマリンで処理した死菌を用いる実験の試薬類の購入に生じた残額を使用し、また通年仔魚を入手できるキリフィシュを用いることで、より充実した研究内容にする。
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