| 研究課題/領域番号 |
18K05831
|
|---|
| 研究機関 | 日本大学 |
|---|
研究代表者 |
伊藤 琢也 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (20307820)
|
|---|
| 研究分担者 |
鈴木 美和 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (70409069)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | イルカ / 細胞株 / 不死化 / 腎臓 / 肺 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究は、イルカ培養細胞の増殖維持に最適化した培地の作製を目指す。また細胞不死化に関わる分子機構は完全には解明されていないが、多数の不死化細胞
株が樹立されている陸生哺乳類では、細胞増殖や細胞老化に関わる遺伝子の人為的な制御による細胞不死化の促進が報告されているため、それらの相同遺伝子は イルカの細胞においても不死化制御の候補遺伝子となりうる。それら候補遺伝子を含む細胞不死化関連遺伝子をイルカで探索するためにイルカの初代培養細胞お よびその継代細胞（老化細胞）を用いた発現遺伝子群の比較解析を行い、不死化関連遺伝子を同定し、ゲノム編集技術を応用してそれらの遺伝子の人為的制御を 行うことによって無限増殖能を有したイルカ不死化細胞の樹立を目指す。
本年度は、昨年度に引き続き、フィールドからのサンプリングによって得た組織由来の細胞について初代培養を試みた。イルカの諸臓器から一般的な組織培養条件のもとで培養を試みたところ、腎臓および肺組織を由来とする細胞において、数継代の培養が維持されることを確認した。諸臓器由来細胞の初代培養を数例試みたが、いずれの場合においても腎臓および肺由来の細胞で数回の継代が可能であった例が観察され、細胞株の樹立には、これらの臓器由来の細胞を用いることが有用である可能性が示唆された。これら増殖が確認できた培養細胞は凍結保存処理を行い、数か月後に凍結融解した後も再度培養が可能であることも確認した。なお、継代を重ねると培養細胞の分裂能力が低下し、継代不可能となったため、増殖能力が活発な細胞と分裂能力が低下した細胞を採材して遺伝子発現解析に供する試料を確保した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、不死化細胞樹立の起点となるイルカの初代培養細胞を当初計画していたサンプリングによって複数の組織から入手することができ、陸生哺乳動物の 組織培養に用いられる一般的な培養液を用いた人工培養下において、複数組織由来の細胞が数継代できることが明らかとなった。特に腎臓および肺由来細胞の増殖効率が高く、不死化細胞株の候補として有力であることが予想された。これらの初代培養細胞については以後の実験に用いるために十分と考えられる細胞が凍結保存サンプルとして確保できた。
また予備的検討ではあるがイルカ組織由来細胞を用いて、外来遺伝子であるGFPの細胞内移入を行ったところ、高効率な遺伝子導入が可能であることが確認できたため、次年度以降に不死化関連遺伝子が同定された場合の遺伝子編集を効率的に行うために不可欠な基礎的知見を得ることができた。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、イルカ不死化細胞株樹立の起点となる初代培養細胞を入手し、基本的な増殖能を把握できたので、最終年度は次の課題に取り組む。すなわち、イルカ細胞の増殖・維持に適した培養液の作製として、細胞を生育するのに不可欠な人工培養液において、特に尿素、浸透圧、必須微量元素などの項目について培養液組成の調整を行い、イルカの体液組成に基づいて調整した培養液を作製する。調整された培養液を用いてイルカ組織由来初代細胞を培養し、細胞増殖、細胞 代謝活性を測定して細胞の増殖・維持に最適かを評価する。
続いて、イルカ細胞における増殖・老化関連遺伝子群の比較解析と標的遺伝子の探索を行う。これまでの予備検討でハンドウイルカの腎臓由来および肺由来初代培養細胞に外来遺伝子を導入して確立した腎由来細胞、肺由来細胞、また比較対照として初代培養細胞を用いて、それぞれの対数増殖期と継代終盤の分裂休止期における遺伝子発現動態を、RNA-Seqによる網羅解析で明らかにする。得られた変動遺伝子のうち、細胞増殖・細胞老化・細胞周期に関わる遺伝子群を対象に 絞り、細胞増殖を負に制御する遺伝子を同定する。
その後、ゲノム編集技術によるイルカ培養細胞の増殖抑制・老化遺伝子のノックアウトをするために細胞周期の停止または細胞老化に関与する候補遺伝子をターゲットにして、組織由来継代細胞あるいは初代培養細胞に対してCRISPER/Cas9システムによるゲノム編集を適用し、不死化細胞株樹立を目指す。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度末に予定していた遺伝子解析受託について、次年度に移行したため次年度使用額が生じたが、翌年度はその予算を予定どおり遺伝子解析受託に充てて計画を遂行する。
|
