| 研究課題/領域番号 |
18K05928
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| 研究機関 | 東京電機大学 |
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研究代表者 |
椎葉 究 東京電機大学, 理工学部, 教授 (20621981)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ヘミセルロース / バイリファイナリー / 桂皮酸類 / コレステロール / 抗酸化能 / NO産生 / 免疫賦活 / 抗炎症性 |
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| 研究実績の概要 |
孟宗竹の成分を段階的に抽出調製するバイオリファイナリーを構築する上で、2018年度は、減圧マイクロ波処理、蒸圧/酵素処理、カラムクロマトグラフィー、溶媒沈殿法、酸沈殿法などの処理法によって成分の分画と分画成分のHPLC/GCによる構造解析と生理活性の相関性を明らかにすることを目的とした。、特に、孟宗竹の蒸圧処理で抽出し細胞壁崩壊酵素により加水分解して抽出した成分（以下BOSと略）、更に酸沈殿により固液分離した成分（上清BOS-S、沈殿物のBOS-Pと略）の化学構造と抗酸化性、血しょうコレステロール抑制効果、免疫活性、抗炎症活性との構造活性相関について研究を行った。
BOS-SとBOS-P中の成分を、HILIC親水性カラムを装着したHPLCで分析した結果、大きく4種の成分（F-1～F-4と略)から構成されており、F-1の成分は、BOS-P中に特に多く含有していた。F-3およびF-4はBOS-S中に特に多く含有していた。HPLC/GCの結果などから、F -3とF-4は桂皮酸をアグリゴンとして、Glucose、Xyloseを配糖体としている可能性が高かった。
また、BOS-Sは、高脂肪食マウスにおける血中コレステロール増加抑制効果を有しており、これらのF-3やF-4の成分が関与している可能性が高かった。さらに、マウスマクロファージRAW264.7細胞を炭酸ガス培養器(5%CO2)で24時間培養後、調製したBOS成分またはコントロールとしてLPSを添加してNOxキット(Griese Reagent)により、NO産生能を比較した。結果として、BOS-Pには免疫賦活作用、BOS-Sには抗炎症作用を有する成分があると予測できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当初計画では、①竹から蒸圧処理と細胞壁崩壊酵素で抽出した成分（BOS）のクロマト分画②クロマト分画したフェルロイルキシログルカン成分（FXG）やフェノール性酸化合物系配糖体（PSC）のRAW264.7 細胞におけるNOx産生能試験③in vivoにおける抗酸化活性試験、④活性を有する成分の化学的構造や化学的特性の決定、⑤化学構造活性相関から生理活性機構の解明、⑤機能性食品や化粧品、医薬品へ利用法を検討し最終的には竹バイオマスのバイオリファイナリーの基盤のひとつを構成する技術を確立する。平成30年度は、主として①竹からのBOS 調製とクロマト分画および②分画成分のRAW264.7 細胞におけるNOx 産生能試験を行うとしており、下述の方法１に従って行った。その結果、平成30年度で行う計画とおり試験をすすめ成果が得られた。その成果を、関連する学会での発表や新規特許を作成した。また、当初平成31年（令和元年）度行う予定であった構③分画成分のin vivo における抗酸化活性試験と④分画成分の構造決定と化学的特性試験および⑤生理機構解明についても、研究は進進捗しており、「当初の計画以上に進展している」と判断される。
方法１/RAW264.7細胞（マウスマクロファージ様細胞株）を5×105cells/mLに調製し、100μLずつを96wellplateに播種する。一晩培養後、培地を除去し、種々の濃度のLPS（Positive Control）または、試料を含む培地100μLを添加する。試料として、BOS、 BOS-S、BOS-P、およびHILIC分画物は、倍希釈系列を作成（×１、×1/2、×1/4、×1/8）後、各希釈系列を10％FCS(豚胎児血清)含有DMEM培地に対して2%（v/v）混和し、添加サンプルとした。22時間培養後、培地中のNOx量をNOx測定キットで定量した。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初平成31年（令和元年）度行う予定であった③分画成分のin vivo における抗酸化活性試験と④分画成分のHPLC/MS、NMRなど機器分析による構造決定と化学的特性試験および⑤培養細胞による生理機構解明について、研究は現在すでに進捗しており研究推進の方策は取られている。しかしながら、将来、バイオリファイナリーシステムを構築するためには大型の蒸圧処理装置が必要である点、細胞壁の崩壊率も抽出されたヘミセルロース分解物から計算すると理論値の20％程度であり投入エネルギーに対して抽出効率が悪い点、細胞壁崩壊酵素も高価であることから製造コストが高い点、などの製造側の課題が見出された。当初から竹バイオリファイナリーの構築には付加価値の高い健康食品素材や化粧品、医薬品へ利用が必要とのコンセプトから、製造の高効率化の検討は当初の研究課題にはなかった。しかし最終的なバイオリファイナリー構築のためには生産の効率化検討も行う必要があり、国）森林総合研究所で開発された減圧マイクロ波処理装置を用いることにより、比較的低温（約70℃）で水蒸気蒸留による揮発性成分抽出と細胞壁崩壊を同時に行うことができる可能性が見出された。この既存装置を用いることにより、高精製度な生理活性成分を従来法よりも効率的に調製できる可能性が見出されて、また新たに、減圧マイクロ波処理装置により竹から抽出された成分に健康素材の可能性が見出され、最終的にバイオリファイナリー構築にプラスの要因が見出されてきている。今後は、この装置の利用により高度に調製された抽出成分の生理活性機構と化学構造との活性相関について研究を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ほぼ計画通りの支出額であり、次年度以降の使用計画通りに進めることは可能であると判断できる。
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