プリオン蛋白の異常化機構解明研究

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K05963
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 小林 篤史 北海道大学, 獣医学研究院, 准教授 (50431507)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: プリオン / クロイツフェルト・ヤコブ病

研究実績の概要

本研究では、遺伝性プリオン病の原因遺伝子変異であるM232R変異がプリオン蛋白異常化を誘導する分子メカニズムを解明することを目指している。M232Rはプリオン蛋白成熟の過程で除去されるGlycosylphosphatidylinositol(GPI)アンカリング シグナルペプチド中に存在するため、変異アレルからも野生型と全く同じアミノ酸配列の成熟プリオン蛋白がつくられる。それにもかかわらず、どうしてM232R変異がプリオン病を引き起こすのか、その理由は分かっていない。
本年度はまず、M232R変異遺伝性プリオン病患者およびM232R変異導入ヒトプリオン蛋白ノックインマウスにおける異常型および正常型プリオン蛋白GPIアンカーのシアル化状態を二次元電気泳動およびレクチンブロットにより解析した。すると、M232R変異プリオン蛋白と野生型プリオン蛋白との間でブロットパターンに差は見られず、シアル化状態に違いは認められなかった。次に、M232R変異遺伝性プリオン病患者およびM232R変異導入ヒトプリオン蛋白ノックインマウスにおける異常型および正常型プリオン蛋白の局在を免疫染色により解析した。すると、M232R変異プリオン蛋白と野生型プリオン蛋白との間で脳内分布に差は見られず、神経細胞内における局在にも違いは認められなかった。
本年度の研究実績によりM232R変異はプリオン蛋白のシアル化および局在には影響しない可能性が示唆された。これらの点をより詳細に確認するため、次年度にはプリオン蛋白の質量分析(LC-ESI-MSMS)およびM232R変異導入ヒトプリオン蛋白ノックインマウス由来初代培養神経細胞の蛍光免疫染色をおこなう。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本年度はまず、M232R変異遺伝性プリオン病患者およびM232R変異導入ヒトプリオン蛋白ノックインマウスにおける異常型および正常型プリオン蛋白GPIアンカーのシアル化状態を二次元電気泳動およびレクチンブロットにより解析した。すると、M232R変異プリオン蛋白と野生型プリオン蛋白との間でブロットパターンに差は見られず、シアル化状態に違いは認められなかった。次に、M232R変異遺伝性プリオン病患者およびM232R変異導入ヒトプリオン蛋白ノックインマウスにおける異常型および正常型プリオン蛋白の局在を免疫染色により解析した。すると、M232R変異プリオン蛋白と野生型プリオン蛋白との間で脳内分布に差は見られず、神経細胞内における局在にも違いは認められなかった。
当初予定では、初年度はM232R変異遺伝性プリオン病患者およびM232R変異導入ヒトプリオン蛋白ノックインマウスにおける異常型および正常型プリオン蛋白GPIアンカーのシアル化状態の解析をおこなうだけの予定であった。しかし初年度のうちに、プリオン蛋白GPIアンカーのシアル化状態の解析に加え、M232R変異遺伝性プリオン病患者およびM232R変異導入ヒトプリオン蛋白ノックインマウスにおける異常型および正常型プリオン蛋白の局在解析もおこない、結果もすでに得ている。
上記の理由から現在までの進捗状況の区分は「(1)当初の計画以上に進展している。」とした。

今後の研究の推進方策

本年度の研究実績により、M232R変異はプリオン蛋白GPIアンカーのシアル化状態およびプリオン蛋白の細胞内/脳内局在には影響しない可能性が示唆された。これらの点をより詳細に確認するため、次年度にはプリオン蛋白GPIアンカーの質量分析(LC-ESI-MSMS)およびM232R変異導入ヒトプリオン蛋白ノックインマウス由来初代培養神経細胞の蛍光免疫染色をおこなう。質量分析では、プリオン蛋白GPIアンカーのシアル化状態がより詳細に分かるだけでなく、シアル酸以外の糖鎖構造の違いの有無も明らかにできると考えられる。また、M232R変異導入ヒトプリオン蛋白ノックインマウス由来初代培養神経細胞でのプリオン蛋白局在解析では、脳組織切片での解析よりもシナプスや細胞小器官への分布が見やすくなると考えられる。これらの解析を通して、M232R変異によってプリオン蛋白GPIアンカーのシアル化状態やプリオン蛋白の細胞内局在が変化するのか結論を出す。また、次年度には、プリオン蛋白GPIアンカーのシアル化をなくすことでプリオン蛋白の異常化に影響が出るかを調べるため、GPIアンカーのシアル化が起きないPGAP4 KOマウスにプリオンを用いてプリオン感染実験を開始する。感染マウスにおける潜伏期間、異常型プリオン蛋白の沈着パターンおよび生化学的性質、病変を解析し、プリオン蛋白GPIアンカーのシアル化抑制がプリオン病の病態に与える影響を調べる。

研究成果

• [雑誌論文] A novel combination of prion strain co-occurrence in patients with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease (2019)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi Atsushi、Iwasaki Yasushi、Takao Masaki、Saito Yuko、Iwaki Toru、Qi Zechen、Torimoto Ryouta、Shimazaki Taishi、Munesue Yoshiko、Isoda Norikazu、Sawa Hirofumi、Aoshima Keisuke、Kimura Takashi、Kondo Hinako、Mohri Shirou、Kitamoto Tetsuyuki
  • 雑誌名: The American Journal of Pathology 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.ajpath.2019.02.012
  • 査読あり
• [雑誌論文] Autopsied case of sporadic Creutzfeldt-Jakob disease pathologically classified as MM1+2C-type (2019)
  • 著者名/発表者名: Iwasaki Y, Kato H, Ando T, Akagi A, Mimuro M, Miyahara H, Kobayashi A, Kitamoto T, Yoshida M.
  • 雑誌名: Neuropathology 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1111/neup.12557
  • 査読あり
• [雑誌論文] Exogenous Expression of Equine MHC Class I Molecules in Mice Increases Susceptibility to Equine Herpesvirus 1 Pulmonary Infection (2019)
  • 著者名/発表者名: Minato Erina、Aoshima Keisuke、Kobayashi Atsushi、Ohnishi Naomi、Sasaki Nobuya、Kimura Takashi
  • 雑誌名: Veterinary Pathology 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1177/0300985819834616
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ganglioside Synthase Knockout Reduces Prion Disease Incubation Time in Mouse Models (2019)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi Atsushi、Qi Zechen、Shimazaki Taishi、Munesue Yoshiko、Miyamoto Tomomi、Isoda Norikazu、Sawa Hirofumi、Aoshima Keisuke、Kimura Takashi、Mohri Shirou、Kitamoto Tetsuyuki、Yamashita Tadashi、Miyoshi Ichiro
  • 雑誌名: The American Journal of Pathology 巻: 189 ページ: 677～686
  • DOI: 10.1016/j.ajpath.2018.11.009
  • 査読あり
• [雑誌論文] Notch2 signal is required for the maintenance of canine hemangiosarcoma cancer stem cell-like cells (2018)
  • 著者名/発表者名: Aoshima Keisuke、Fukui Yuki、Gulay Kevin Christian Montecillo、Erdemsurakh Ochbayar、Morita Atsuya、Kobayashi Atsushi、Kimura Takashi
  • 雑誌名: BMC Veterinary Research 巻: 14 ページ: 301
  • DOI: 10.1186/s12917-018-1624-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] Specific amyloid-β42 deposition in the brain of a Gerstmann-Str?ussler-Scheinker disease patient with a P105L mutation on the prion protein gene (2018)
  • 著者名/発表者名: Furukawa Fumiko、Sanjo Nobuo、Kobayashi Atsushi、Hamaguchi Tsuyoshi、Yamada Masahito、Kitamoto Tetsuyuki、Mizusawa Hidehiro、Yokota Takanori
  • 雑誌名: Prion 巻: 12 ページ: 315～319
  • DOI: 10.1080/19336896.2018.1541689
  • 査読あり
• [雑誌論文] Anti-Horse Podoplanin Monoclonal Antibody PMab-219 is Useful for Detecting Lymphatic Endothelial Cells by Immunohistochemical Analysis (2018)
  • 著者名/発表者名: Kato Yukinari、Yamada Shinji、Itai Shunsuke、Kobayashi Atsushi、Konnai Satoru、Kaneko Mika K.
  • 雑誌名: Monoclonal Antibodies in Immunodiagnosis and Immunotherapy 巻: 37 ページ: 272～274
  • DOI: 10.1089/mab.2018.0044
  • 査読あり
• [雑誌論文] Detection of Alpaca Podoplanin by Immunohistochemistry Using the Antibovine Podoplanin Monoclonal Antibody PMab-44 (2018)
  • 著者名/発表者名: Kato Yukinari、Yamada Shinji、Itai Shunsuke、Konnai Satoru、Kobayashi Atsushi、Kaneko Mika K.
  • 雑誌名: Monoclonal Antibodies in Immunodiagnosis and Immunotherapy 巻: 37 ページ: 269～271
  • DOI: 10.1089/mab.2018.0037
  • 査読あり
• [雑誌論文] Immunohistochemical Detection of Sheep Podoplanin Using an Antibovine Podoplanin Monoclonal Antibody PMab-44 (2018)
  • 著者名/発表者名: Kato Yukinari、Yamada Shinji、Itai Shunsuke、Kobayashi Atsushi、Konnai Satoru、Kaneko Mika K.
  • 雑誌名: Monoclonal Antibodies in Immunodiagnosis and Immunotherapy 巻: 37 ページ: 265～268
  • DOI: 10.1089/mab.2018.0036
  • 査読あり
• [雑誌論文] An autopsy report of three kindred in a Gerstmann-Str?ussler-Scheinker disease P105L family with a special reference to prion protein, tau, and beta-amyloid (2018)
  • 著者名/発表者名: Ishizawa Keisuke、Mitsufuji Takashi、Shioda Kei、Kobayashi Atsushi、Komori Takashi、Nakazato Yoshihiko、Kitamoto Tetsuyuki、Araki Nobuo、Yamamoto Toshimasa、Sasaki Atsushi
  • 雑誌名: Brain and Behavior 巻: 8 ページ: e01117～e01117
  • DOI: 10.1002/brb3.1117
  • 査読あり
• [雑誌論文] A domain responsible for spontaneous conversion of bank vole prion protein (2018)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi Atsushi、Matsuura Yuichi、Takeuchi Atsuko、Yamada Masahito、Miyoshi Ichiro、Mohri Shirou、Kitamoto Tetsuyuki
  • 雑誌名: Brain Pathology 巻: 29 ページ: 155～163
  • DOI: 10.1111/bpa.12638
  • 査読あり
• [雑誌論文] Generation and validation of novel anti-bovine CD163 monoclonal antibodies ABM-1A9 and ABM-2D6 (2018)
  • 著者名/発表者名: Shimamoto Yoshinori、Nio-Kobayashi Junko、Watarai Hiroshi、Nagano Masashi、Saito Natsuko、Takahashi Eiki、Higuchi Hidetoshi、Kobayashi Atsushi、Kimura Takashi、Kitamura Hiroshi
  • 雑誌名: Veterinary Immunology and Immunopathology 巻: 198 ページ: 6～13
  • DOI: 10.1016/j.vetimm.2018.02.004
  • 査読あり
• [学会発表] What is abnormal prion protein (PrPSc)? (2018)
  • 著者名/発表者名: Atsushi Kobayashi
  • 学会等名: 19th International Congress of Neuropathology
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Characterization of “sporadic CJD” with history of neurosurgery to identify iatrogenic cases (2018)
  • 著者名/発表者名: Tsuyoshi Hamaguchi,1 Kenji Sakai,1 Atsushi Kobayashi,2 Tetsuyuki Kitamoto,3 Ryusuke Ae,4 Yosikazu Nakamura,4 Nobuo Sanjo,5 Kimihito Arai,6 Mizuho Koide,6 Fumiaki Katada,7 Masafumi Harada,8 Hiroyuki Murai,9 Shigeo Murayama,10 Tadashi Tsukamoto,10 Hidehiro Mizusawa,10 Masahito Yamada.1
  • 学会等名: EuroCJD meeting 2018
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 遺伝性CJD-V180Iの脳に蓄積するプリオン蛋白の解明 (2018)
  • 著者名/発表者名: 三條伸夫、日詰正樹、伊藤陽子、小林篤史、佐藤克也、大上哲也、浜口毅、山田正仁、北本哲之、水澤英洋、横田隆徳
  • 学会等名: 第37回日本認知症学会学術集会
  • 招待講演