2019 年度実施状況報告書

豚の大腸菌感染症トキソイドワクチン開発とその発展的技術基盤構築

研究課題

研究課題/領域番号	18K05976
研究機関	琉球大学
研究代表者	新川武琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 教授 (50305190)
研究分担者	玉城志博琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 助教 (00720822)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2021-03-31
キーワード	腸管毒素原性大腸菌 / 易熱性腸管毒素（LT） / B鎖５量体(LTB) / 封入体発現 / タンパク質巻き戻し / ワクチン開発 / 融合タンパク質 / 多価ワクチン
研究実績の概要	本研究事業「豚の大腸菌感染症トキソイドワクチン開発とその発展的技術基盤構築」では、毒素原性大腸菌（ETEC）が産生する易熱性腸管毒素（LT）に対する組換えワクチンの開発を進めている。その標的分子は、LTのB鎖（LTB）である。LTBはホモ５量体を形成することではじめてワクチン抗原として機能する。しかし、LTBは構造的・機能的に類似したコレラ毒素（CT）のB鎖（CTB）と比べ、特に大腸菌での分泌発現効率が低い。さらに、LTBはCTBと比べ、封入体からの巻き戻しも困難である。ただし、LTBの分泌発現効率が低いのは、宿主側（大腸菌）の性質であり、コレラ菌ではLTBもCTB同様、比較的よく分泌する。しかし、組換え実験にコレラ菌を応用するのは一般的ではなく、大腸菌実験株を利用する方が望ましい。さらに、LTBとCTBとに関わらず、これらの分子と他の分子とを融合させ、多価ワクチン（複数の標的分子によって複数の感染症のワクチンとすること）を構築しようとすると、大腸菌はもちろんのこと、コレラ菌でもその分泌効率が顕著に低下する。したがって、大腸菌でLTB（あるいはLTB融合タンパク質）を産生させる場合、大腸菌ペリプラズムから可溶性タンパク質として回収する方法が主流である。しかし、この方法ではタンパク質回収量が限定的で、ワクチン製造法として利用することは困難である。したがって、LTB（あるいはLTB融合タンパク質）をワクチン分子として工業レベルで製造するには、一旦、大腸菌の封入体に発現させ、そこから巻き戻すことが望ましい場合が多い。しかし、LTBはCTBと比較し、封入体からの巻き戻しが困難であることが問題をさらに複雑にしている。このLTBの巻き戻しの困難さを克服するため、我々はLTB自体に分子改変を施すことで、効率的に巻き戻し可能な変異型LTB分子の開発を進めている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由 LTBの分子改変を施すことによって、その巻き戻し効率に一定の効果が認められた。すなわち、野生型LTBと比べ、変異型LTBは巻き戻し効率が向上した。したがって、「おおむね順調に進展している」とした。
今後の研究の推進方策	LTBに分子改変を施すことで、タンパク質巻き戻し効率を高められる可能性が示唆された。しかし、さらに複数の変異型LTBを遺伝子構築し、機能解析することが必要であると考えている。さらに、LTBの巻き戻し方法自体の開発も必要であると考えている。タンパク質の巻き戻しには、一般的に透析法が用いられるが、LTBに最も適した透析方法を見出す必要がある。さらに、LTBと融合させる抗原タンパク質もLTBを基に確立された巻き戻し法で同時に巻き戻される必要があるため、LTBと同時に融合タンパク質の巻き戻し条件も検討する必要がある。