| 研究課題/領域番号 |
18K05986
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
花木 賢一 国立感染症研究所, 動物管理室, 室長 (40376421)
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| 研究分担者 |
滝本 一広 国立感染症研究所, 動物管理室, 主任研究官 (70280766)
森 一泰 国立感染症研究所, エイズ研究センター, 主任研究官 (20270655)
田原口 元子 国立感染症研究所, 動物管理室, 主任研究官 (20392326)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ノロウイルス / 持続感染 / レトロウイルス |
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| 研究実績の概要 |
マウスノロウイルス（MNV）持続感染細胞株の内、MNV高産生株であるMNV-S7持続感染細胞について継代を継続した。その間、細胞内MNV抗原は間接蛍光抗体法（IFA）解析により徐々に量の低下が見られ、170継代を過ぎて蛍光観察できないレベルにまで低下した。定量RT-PCR解析によりウイルス複製は確認できたが、ウイルスRNA量はIFA解析で細胞内MNV抗原が明瞭に認められた時点の1/100程度であった。そこで、MNV高産生持続感染細胞を復帰させるため、90継代時に凍結保存した細胞を起こして継代を再開した。
凍結保存から起こして110継代時のMNV-S7持続感染細胞において、ウイルス複製に関わる細胞の割合を明らかにするため、抗MNV血清とウイルス複製時に認められるdsRNAを認識するマウスモノクローナル抗体を用いて二重染色を行った。その結果、ウイルス抗原はほぼすべての細胞で認めたが、dsRNAは約20％の細胞、特に死細胞で観察された。そこで、持続感染は以下のメカニズムにより維持されると推察される。ウイルスを取り込んだ細胞の内、約20％においてウイルスが複製する。細胞はウイルス複製に伴ってアポトーシスにより壊れ、新たなウイルス粒子が培地へ放出される。培地中のウイルスを取り込んだ細胞のほとんどは、ウイルスが複製すること無く細胞分裂あるいは壊死する。
Moloney murine leukemia virus（Mo-MuLV）のゲノム情報を基に複数のプライマーを設計し、RAW264.7細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。得られたPCR産物をクローニングしてシーケンス解析を行い、RAW264.7細胞由来MuLVのgag及びpol遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、gag遺伝子では5塩基、pol遺伝子では14塩基がMo-MuLVと異なることを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当該年度は①RAW264.7細胞とMNV持続感染細胞のサイトカイン産生量解析、②MNV持続感染細胞の抗ウイルス薬処理の有無によるMuLVとMNV産生量の解析、③CRISPR-Cas9システムを用いたMuLV増殖阻害とMNV産生量の解析について実施する計画であった。そして、③はMNV非感染RAW264.7細胞を用いて行うことができるため、計画通りに実施できた。しかし、①と②はMNV高産生持続感染細胞を用いる実験であるため、計画通りに実施できなかった。
MNV高産生持続感染細胞を維持できなかった原因として、細胞増殖が良好なために継代間隔を短縮したことでウイルスの脱落が起きたと考えられる。そこで、MNV-S7持続感染細胞の継代は90継代目にまで遡って再開した。①と②の実験は次年度以降に着手できると考え、「やや遅れている。」と評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
以下の項目について実施する。
１）ゲノムシーケンス解析を基にgag及びpol遺伝子を標的にしてガイドRNAを設計し、CRISPR-Cas9システムを用いて次のことを行う。①MuLV非増殖RAW264.7細胞株を樹立し、MuLV増殖RAW264.7細胞株とMuLV非増殖RAW264.7細胞株にMNVを感染させ、その産生量を比較することでMNVの増殖にMuLVが関与するかを明らかにする。②MNV高産生持続感染細胞において、MuLVの増殖を阻害する前後でのMNV産生量を解析し、 MNVの持続感染維持にMuLVが関与するかを明らかにする。
２）MNV持続感染が短期間で終わることが報告されているWEHI-231細胞について、RAW264.7細胞から回収したMuLVにより形質転換させる。そして、形質転換によりMNVの持続感染期間が長期化するか否かを検証し、MNV持続感染にMuLVが関与するかを明らかにする。
３）当該年度に実施できなかったRAW264.7細胞とMNV持続感染細胞のサイトカイン産生量解析、MNV持続感染細胞の抗ウイルス薬処理の有無によるMuLVとMNV産生量の解析について実施する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
MNV持続感染による細胞の性状変化を解析することを目的として、当該年度にMNV持続感染RAW264.7細胞と未感染RAW264.7細胞のサイトカインの発現を網羅的に調べる計画であった。
そのためのサイトカイン抗体マイクロアレイ分析は外部委託により実施する予定であったが、MNV高産生持続感染細胞に問題があり着手できなかった。また、同様の理由で抗ウイルス薬を用いた実験も着手できなかった。その結果、次年度使用額が発生した。一方、CRISPR-Cas9システムの設計では RAW264.7細胞から抽出したゲノムDNAより順調にMuLVのgagおよびpol遺伝子の塩基配列を決定することができた。その結果、コンピテントセルやライゲーション試薬等の購入量を計画立案時に比べて少なくできたために次年度使用額が発生した。
次年度使用額はMNV高産生持続感染細胞を復帰を前提として、外部委託によるサイトカインの発現解析あるいは対象とするサイトカインを絞ってELISAキットを購入（自家解析）、抗ウイルス薬の購入に充てる。また、 CRISPR-Cas9システムに必要な試薬や細胞培養に必要な消耗品等の購入に充てる。
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