| 研究課題/領域番号 |
18K05986
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
花木 賢一 国立感染症研究所, 安全実験管理部, 部長 (40376421)
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| 研究分担者 |
滝本 一広 国立感染症研究所, 安全実験管理部, 室長 (70280766)
田原口 元子 国立感染症研究所, 安全実験管理部, 主任研究官 (20392326)
森 一泰 国立感染症研究所, エイズ研究センター, 主任研究官 (20270655) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ノロウイルス / レトロウイルス / 共感染 / 持続感染 |
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| 研究実績の概要 |
マウスノロウイルス（MNV）の感受性細胞は数株が知られているが、増殖効率が良いと報告されているRAW264.7細胞（Retrovirology 5:1, 2008）とBV-2細胞（Virol J. 6:196, 2009）は共にレトロウイルスを産生していることが報告されている。一方、MNVの増殖効率が悪いWEHI-231細胞はレトロウイルスを産生せず、WEHI-231細胞におけるMNV持続感染も20日に止まっており（Science 346:755-759，2014）、我々が樹立したRAW264.7細胞のMNV持続感染が一年以上維持できるのに比べて短期間である。さらに、AIDS患者でノロウイルス慢性感染が報告されていること（J Clin Virol. 49:219-22, 2010）を踏まえ、MNVはレトロウイルスと共存することで効率よい増殖と長期の持続感染が成立するのではないかと考えて本研究を行っている。これまで、IFN-γや逆転写酵素阻害剤等の抗ウイルス薬処理によりRAW264.7細胞の内在性レトロウイルス（MuLV）のみを増殖阻害できないか検討したが、細胞毒性と内在性MuLV特異的な増殖阻害を行うための最適化はできなかった。そこで、内在性MuLVをゲノム編集により不活化する方法に限定して検討を続けている。そして、RAW264.7細胞由来MuLVのgagおよびpol遺伝子を標的としたガイドRNAの配列（4箇所）をGuide-it CRISPR/Cas9システムを用いてプラスミドベクターにクローニングし、RAW264.7細胞へトランスフェクションした。しかし、導入効率が極めて低く、内在性MuLVの不活化したRAW264.7細胞の単離および細胞株の樹立には至っていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本研究では、（1）RAW264.7細胞とMNV持続感染細胞のサイトカイン産生量解析、（2）MNV持続感染細胞の抗ウイルス薬処理の有無によるMuLVとMNV産生量の解析、（3）CRISPR/Cas9システムを用いたMuLVの増殖阻害とMNV産生量の解析について行うとしたが、研究目的に適した抗ウイルス薬の選定ができていないために（1）と（2）は進展できていない。また、（3）はCRISPR/Cas9システムを用いた内在性MuLVを不活化したRAW264.7細胞株の樹立を試みているが、樹立には至っていない。そのため「遅れている」と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
RAW264.7細胞はトランスフェクションが困難な細胞株である。そこで、RAW264.7細胞へのトランスフェクション効率が高いとされている試薬を用いてDNA導入を試み、内在性MuLVを不活化したRAW264.7細胞株の樹立を目指す。内在性MuLV不活化RAW264.7細胞株が樹立できた場合には、従来のRAW264.7細胞と共にマウス個体では一週間程度で排除されるMNV-1と一ヶ月以上慢性的に感染が持続するMNV-S7の感染実験を行って感染価とウイルスRNA量について比較する。また、感染耐過した細胞の継代培養を行ってMNV持続感染細胞の樹立と経過観察を行って、MuLV産生の有無によるMNV増殖並びにMNV持続感染への影響を評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルス感染症緊急事態宣言発令により、所属機関において通常の研究を中断してテレワークを行うよう指示されたこと、参加予定であった学術集会が中止になったこと、新型コロナウイルスに関する重点研究へ参画する必要があったこと、実験に必要な消耗品が入手できなかったこと。これらにより予定通りの研究費執行ができなかった。
本研究は当該年度が最終年度であったが、予定通りに研究を行うことができなかった。そこで、期間を一年延長して継続して研究に取り組むこととし、未使用額はそれに充当する。
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