| 研究課題/領域番号 |
18K06002
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| 研究機関 | 酪農学園大学 |
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研究代表者 |
桐澤 力雄 酪農学園大学, 獣医学群, 教授 (70153252)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 馬媾疹 / 馬ヘルペスウイルス3型 / 貼るワクチン / 迅速診断法 |
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| 研究実績の概要 |
馬媾疹は、馬ヘルペスウイルス3型（EHV3）に起因し、主に交配で伝播する。本病を発症すると外部生殖器に丘疹や水疱が生じ、痛みを伴うため交配が2～3週間不可能となり、交配料の高い種牡馬では数億円の損害に達する。本研究では本病を現場で迅速に診断できるEHV3検出キットの開発と生殖器への感染防御を目的として感染防御抗原をコードするmRNAを微小針に封入した貼るワクチンによる経皮ワクチンを開発する。平成30年～令和元年度の研究で以下の成績を得た。
１．EHV3検出キット開発
EHV3に対するモノクローナル抗体を30種類得た。そのうち、抗体のサブタイプがIgGのもの18種類について、認識するウイルス蛋白を調べたところ、15種類がエンベロープ糖タンパクgB、2種類がgJそして1種類がgCであった。gBに対するモノクローナル抗体のエピトープを競合ELISAで解析したところ、最低3種類のグループに分類された。エピトープ認識の異なるモノクローナル抗体のうちEHV3との反応性が高いものを選択して、捕捉抗体および検出抗体とするサンドイッチELISAによるEHV3検出系を作出した。この組み合わせを簡易検出キットに応用する。
２．経皮ワクチン開発
感染防御抗原の候補となるウイルス蛋白14種類（エンベロープ糖タンパク：gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gMとgN；遺伝子発現調節蛋白：ICP4とICP22）を動物細胞で発現する組換えプラスミドを構築し、動物細胞で発現させた。この細胞とEHV3抗体陽性馬5頭の血清との反応性を間接蛍光抗体法で調べたところ、5頭の馬全ての血清が反応したウイルス蛋白はgB、gD、gGとgIであった。これらの4種類のウイルス蛋白が感染防御に有効と考えられ、これらの蛋白を発現するmRNAをワクチン候補とする。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
１．特異的にEHV3を検出するELISA系の確立に時間を要した。それが確立できてから、ELISA検出系の候補となるモノクローナル抗体の選抜を終えたのが年度末になったため。
２．EHV3のウイルス蛋白を動物細胞で発現する組換えプラスミドとEHV3感染馬血清を用いての感染防御抗原の候補決定までは順調であったが、効率の良いmRNA発現方法の確立に時間を要しているため。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．馬媾疹の迅速診断法の確立
令和元年度の研究で得られた抗EHV3 gBモノクローナル抗体を用いたサンドイッチELISAによるEHV3検出系を、北海道の簡易キット開発メーカーと共同で簡易キットを構築する。
２．馬媾疹の予防法の確立
令和元年度の研究で明らかとなったワクチン候補蛋白、gB、gD、gGとgIの4種類をそれぞれコードする遺伝子をmRNA合成用プラスミドにクローニングしてmRNAを大量に合成する。mRNAの細胞内の安定性を高めて蛋白発現量を多くするため、UTPの代わりに1-methylpseudouridine-5’-triphosphateを用いる。皮膚に接すると溶解する素材でできた微小針内にそれらのmRNAを封入し、貼付け型経皮ワクチンとする。この工程は京都のメーカーと共同して行う。試作したワクチンは野外馬に応用し、抗体の誘導能を中和試験等で調べる。その成績をもとに、ワクチンを構成するmRNAの組み合わせを決定し、最終候補ワクチンとする。再度、野外試験を実施して、抗体の誘導能を確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和元年度に予定していた実験に少し遅れが生じたため、翌年度に繰り越した。繰り越した助成金は「その他」の部分の経費に充てる予定。
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