異種間顕微授精によるトゲネズミ雄性2倍体胚由来ES細胞の樹立と配偶子形成の誘導

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K06021
• 研究機関: 近畿大学
• 研究代表者: 三谷 匡 近畿大学, 生物理工学部, 教授 (10322265)
• 研究分担者: 田辺 秀之 総合研究大学院大学, 先導科学研究科, 准教授 (50261178) ; 岡村 大治 近畿大学, 農学部, 講師 (80393263)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 雄性2倍体胚 / ハイブリッド胚 / ES細胞 / FISH解析 / 顕微授精

研究実績の概要

本課題において、平成30年度はトゲネズミ精子を想定した異種間モデル実験として、ES細胞が樹立されマウス胚とのキメラ形成能も確認されているモリアカネズミを用いて実施したが、モリアカネズミ精子を用いた異種間雄性２倍体は前核形成ののち発生を停止した。そこで、マウス卵子がモリアカネズミ精子を受容しうるかを検証するために、ハイブリッド胚の作製を試みたが、異種間顕微授精胚は前核形成で発生を停止した。
令和元年度は、ハイブリッド胚の受精過程における解析と発生能の獲得に関する研究を行った。モリアカネズミ精子頭部をマウス卵子に注入した際、マウス雌性前核の形成に対してモリアカネズミ雄性前核の形成において精子頭部の膨化に遅延がみられることが明らかとなった。Triton X-100 (TX)処理による先体酵素の除去および精子細胞膜の不安定化が前核形成を促し胚の発生率を改善することが報告されていることから、同処理を施したモリアカネズミ精子における前核形成過程について検討した。その結果、TX(+)処理異種間顕微授精胚おいて、活性化処理後2-3時間での精子頭部の膨化および２前核の形成過程が観察され、TX未処理同種間顕微授精胚の雄性前核形成に近似した過程を辿ることが明らかとなった。しかしながら、既報とは異なり、TX処理を施した顕微授精胚は、同種間、異種間に関わらず胚盤胞への発生率が著しく低下し、Triton X-100による精子の前処理は受精後の胚発生に影響を及ぼしていることが示された。２前核を形成し卵割が進行した胚がハイブリッドであることを確認するため、マウスおよびモリアカネズミのGPR33遺伝子領域に対するRFLP解析を行った結果、TX(+)異種間顕微授精由来２細胞期胚はハイブリッドであることが示された。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

本申請で計画していた異種精子を用いた雄性２倍体胚由来ES細胞の樹立については、動物種の変更と雄性２倍体胚の作製からハイブリッド胚の作製への変更の２段階の計画修正を行っている。
平成30年度は、モリアカネズミ精子を用いた雄性２倍体胚の作製とES細胞の樹立を試みたが、胚発生が停止したことから、さらにマウス卵子への異種間顕微授精によるハイブリッド胚の作製と解析へと計画を修正した。異種間顕微授精由来胚盤胞からES様細胞が樹立されたものの、マルチカラー染色体ペインティングによるFISH解析の結果、モリアカネズミ染色体の脱落の可能性が考えられた。
そこで令和元年度は、異種精子の顕微授精後の前核形成過程に焦点を絞り解析を行った。その結果、モリアカネズミ精子は雄性前核の形成が遅延しマウス雌性前核の形成過程と同調しないこと、先体酵素の除去や精子細胞膜の不安定化によりモリアカネズミ雄性前核形成の遅延が大きく改善されること、一方で、精子の前処理は受精後の胚発生能を損なうことが明らかとなった。なお、本年度計画していたマウス近縁種である同属異種のオキナワハツカネズミ(Mus caroli)や亜種のアルジェリアハツカネズミ(Mus spretus)の利用については次年度の実施を予定している。したがって、現在の進捗状況としては計画より遅れていることは否めない。一方で、計画の修正により行ったハイブリッド胚を用いた解析は、異種間クローン胚や異種精子由来雄性２倍体胚の発生能を予測する指標として有効となれば派生的な成果へと発展する可能性がある。また、哺乳動物の種間の生殖隔離に関する新たな仕組みを探る糸口となりうる興味深い事象である。本研究を足掛かりに、異種精子の活性化や胚発生を促すレスキュー法など周辺技術の開発を行い、異種精子由来雄性２倍体胚からのES細胞の樹立へとつなげることで最終成果の達成を目指す。

今後の研究の推進方策

今後は、引き続き、モリアカネズミ－マウスハイブリッド胚ES細胞の樹立をめざすとともに、マウスと近縁な別種を用いてハイブリッドES細胞ならびに雄性２倍体胚由来ES細胞の樹立をめざす。
ハイブリッド胚の発生能の向上については、Triton X-100処理条件の最適化を図る。また、精子細胞膜を不安定化させるリゾレシチン(LL)は、精子先体反応に関与するホスホリパーゼA（PLA）による膜リン脂質の加水分解産物であるため、短時間の精子への暴露は精子核に悪影響を及ぼさないことが報告されている。そこで、LLを用いた精子の処理条件についても検討を行う。そして発生したハイブリッド胚盤胞よりES細胞を樹立する。樹立したES細胞については、平成30年度と令和元年度にそれぞれ確立した染色体解析と遺伝子解析を適用してハイブリッドの検証を行う。遺伝子解析については、異なる染色体にコードされる複数の遺伝子をターゲットとしたRFLP解析を行う。染色体解析については、モリアカネズミ染色体はマウス染色体の相同領域が転座によりマウス染色体ペインティングプローブに対してモザイクのカラーパターンを示すことから、マルチカラーFISHによる解析を行う。一方、モリアカネズミはマウスとは属が大きく異なり、ハイブリッド胚の発生が困難であったことが考えられる。そこで、ハイブリッド個体の発生が示されている同属間、例えば、同属異種のオキナワハツカネズミ(Mus caroli)や亜種のアルジェリアハツカネズミ(Mus spretus)を用いて同様の実験を行う。そして、本研究により最適化されたハイブリッドES細胞の樹立条件を適用して、異種間顕微授精による雄性２倍体胚の作製ならびにES細胞の樹立をめざす。また、本研究から派生する成果として、種の分岐における生殖隔離に関する新たな知見につながる可能性も期待される。

次年度使用額が生じた理由

次年度使用額については少額であり、次年度の直接経費と合わせて使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Signs of biologucal activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yamagata K, Nagai K, Miyamoto H, Anzai M, Kato H, Miyamoto K, Kurosaka S, Azuma R, Kolodeznikov II, Protopopov AV, Plotnikov VV, Kobayashi H, Kawahara-Miki R, Kono T, Uchida M, Shibata Y, Handa T, Kimura H, Hosoi Y, Mitani T, Matsumoto K, Iritani A.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 9 ページ: 4050
  • DOI: 10.1038/s41598-019-40546-1
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Transcriptional activity and morphological changes of somatic cell nuclei transferred into germinal vesicle stage oocytes. (2019)
  • 著者名/発表者名: Okumura I, Minobe K, Mitani T, Kurosaka S.
  • 学会等名: American Society for Cell Biology Annual Meeting (ASCB2019)
  • 国際学会
• [学会発表] GV期卵母細胞に核移植された体細胞核の転写活性および形態変化． (2019)
  • 著者名/発表者名: 美濃部晃平，奥村樹，三谷匡，黒坂哲．
  • 学会等名: 第42回日本分子生物学会年会
• [図書] 繁殖生物学（改訂版）第6章５「遺伝子改変動物」 (2020)
  • 著者名/発表者名: 南直次郎、三谷匡、黒坂哲、藤井渉
  • 総ページ数: 351（掲載頁331-339）
  • 出版者: インターズー
  • ISBN: 978-4-86671-110-2