| 研究課題/領域番号 |
18K06027
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| 研究機関 | 山梨大学 |
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研究代表者 |
伊藤 禎洋 山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (30345722)
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| 研究分担者 |
長友 啓明 山梨大学, 大学院総合研究部, 特任助教 (30746813)
神沼 修 山梨大学, 大学院総合研究部, 准教授 (80342921)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ゲノム編集 / 炎症の系統差 / miRNA / 転写因子 / 結合配列 |
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| 研究実績の概要 |
我々は、当初、抗核抗体価の上昇を指標として、C57BL/6系統の遺伝子背景（Apcs-/-; 129/Sv//Ev × C57BL/6）に存在する129/Sv//Ev領域｛D1Mit36（76.73cM）からD1Mit115（82.78cM）｝の免疫に関係する遺伝子群をランダムに20遺伝子、ゲノム編集法で破壊する予定でいた。
Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Aug 22;114(34):9158-9163.Complete overview of protein-inactivating sequence variations in 36 sequenced mouse inbred strainsの論文より、C3H/Heマウスは、LPS刺激、IL1α経由の感染に対して耐性であると解った。このことにより、C3H/He系統の遺伝子背景では、炎症のシグナルが入らないために抗核抗体値上昇が起きないのであろうと解った。
従って、同じように、ゲノム編集法で破壊した遺伝子が、抗核抗体価の上昇に関わる遺伝子であるか否かが解るが、抗核抗体値上昇の原因であるとは結論出来ないと解った。
加えて、抗核抗体値上昇の原因が遺伝子のみとは、かぎらない。miRNAの可能性もあり、転写因子が結合する結合配列の可能性もある。
したがって、Apcs-/- C57BL/6系統の遺伝子背景(129/Sv//Ev領域)をゲノム編集の手法を用いて、削っていくこと方針転換した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
闇雲にApcs-/- C57BL/6系統の遺伝子背景(129/Sv//Ev領域)を削っていくことには抵抗がある。地図のようなものを文献からさがした。
Curr Top Microbiol Immunol. 2017;410:249-267. MicroRNA in Immune Regulation.
Cell. 2019;176:897-912. The cis-Regulatory Atlas of the Mouse Immune System.
これらの文献を参考にして、削る領域を決定する。
手法は、Floxを導入することにした。Creの発現により、削る組織を調整できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
C57BL/6系統の遺伝子背景（Apcs-/-; 129/Sv//Ev × C57BL/6）に存在する129/Sv//Ev領域｛D1Mit36（76.73cM）からD1Mit115（82.78cM）｝をゲノム編集の手法を用いて、削っていく。また、比較のために、 C57BL/6においても、同様にApcs-/-として、相同領域を削っていく。
抗核抗体値上昇のみを指標とすると、マウス作製後、9ヶ月以上待たないといけない。作製したそれぞれのマウス肝臓切片を培養し、IL6で刺激する。その切片からRNAを抽出して、抗核抗体値上昇（炎症）に関係する遺伝子のqPCRを行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験手法の転換のため、C57BL/6系統の遺伝子背景（Apcs-/-;129/Sv//Ev x C57BL/6)に存在する129/Sv//Ev 領域｛D1Mit36(76.73cM)からD1Mit115(82.78cM)}に存在する免疫に関係する遺伝子をランダムに破壊する事は、中止した。
代わりに、その領域を削っていくことにした。地図の代わりになる文献を探して次の文献を見いだした。Curr Top Microbiol Immunol. 2017;410:249-267. MicroRNA in Immune Regulation. Cell. 2019;176:897-912. The cis-Regulatory Atlas of the Mouse Immune System.
これらの文献を参考して、Floxを導入して、その129/Sv//Ev 領域｛D1Mit36(76.73cM)からD1Mit115(82.78cM)}を削り、作製したマウス肝の切片を培養する。IL6で刺激して、抗核抗体値上昇に関連する遺伝子発現をqPCRで比較する。
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