| 研究課題/領域番号 |
18K06028
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
椛嶋 克哉 京都大学, 医学研究科, 特定研究員 (30615422)
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| 研究分担者 |
高林 秀次 浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 准教授 (70372521)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | シリアンハムスター / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / 生殖工学 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度までに、in vitro受精卵エレクトロポレーション法を用いることでゲノム編集ハムスターの作製に成功しているが、産仔中のゲノム編集個体作製効率が13-50%と低いという課題があった。今年度は定電流エレクトロポレーターを新たに導入することで、抵抗値調整の煩雑な作業を不要とし、体外環境に受精卵を曝露する時間を削減した。エレクトロポレーションの条件についても、卵割率に影響することなくCRISPR/Cas9システムを導入する最適な条件を決定した。さらに、in vitroエレクトロポレーション後の受精卵を偽妊娠雌に移植しても妊娠が継続し、産仔が得られることを明らかにした。これらの改良により、産仔中のゲノム編集個体作製効率が100%へと向上した。現在、受精卵の回収、CRISPR/Cas9システムの導入（in vitro受精卵エレクトロポレーション法）、胚移植等の一連の工程のプロトコル化を進めている。複数の遺伝子においてKO個体が得られており、シリアンハムスターにおけるKO個体作製技術は確立することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究期間中に所属機関の異動があったため、新たに実験系を立ち上げる必要があった。また、COVID-19の影響で、一部試薬・機器類の入手に時間を要した。過排卵処理後に交配が成立しても受精卵が得られないケースがみられ、抗インヒビン血清単独処理等も検討したが、排卵数が増えると未受精となってしまう問題があった。自然排卵個体では効率的に受精卵が得られるものの、排卵数が限られることから使用動物数が増えるため、過排卵処理後も効率的に受精卵が得られる方法の検討を進めている。ただ、複数の遺伝子においてKO個体が得られており、やや遅れているもののシリアンハムスターにおけるKO個体作製技術は確立できている。
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| 今後の研究の推進方策 |
受精卵の回収、CRISPR/Cas9システムの導入（in vitro受精卵エレクトロポレーション法）、胚移植等の一連の工程をプロトコル化し、公表する。In vitro受精卵エレクトロポレーション法は、短鎖及び長鎖のドナーDNAも効率的に導入することが期待できる手法であるため、KIシリアンハムスターの作製についても検討する。系統保存のための生殖工学技術については、胚凍結を優先して進める。偽妊娠雌をレシピエントとした凍結融解胚移植では産仔が得られなかったため、妊娠雌への胚移植を行う。その際、チロシナーゼ遺伝子をKOしたアルビノシリアンハムスターを系統化し、受胚雌として用いる。一部、交配では次世代が得られていないKO系統があるため、ラット等の手法を参考にし、新鮮精子を用いた人工授精により産仔が得られるか検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究期間中に所属機関の異動があったため、新たに実験系を立ち上げる必要があった。また、COVID-19の影響で一部試薬・機器類の入手に時間を要したため、残金が生じた。残金については、研究成果の公表や、令和3年度に実施することができなかった残りの計画に使用する。
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