| 研究課題/領域番号 |
18K06042
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| 研究機関 | ヤマザキ動物看護大学 |
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研究代表者 |
梅村 隆志 ヤマザキ動物看護大学, 動物看護学部, 教授 (50185071)
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| 研究分担者 |
高須 伸二 国立医薬品食品衛生研究所, 病理部, 主任研究官 (00597891)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 肝再生 / Nrf2 / Notch |
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| 研究実績の概要 |
本研究目的は、部分肝切除モデルを用いた研究から提唱されたON/OFF制御を起終点とした急性増殖シグナルにおけるNrf2によるNotchシグナル制御に着目し、我々が樹立した結節性肝再生モデルを用いて、持続性肝再生シグナルにおけるON/OFF制御の実態とそこに関わるNrf2によるNotchシグナル制御機構を明らかにすることである。本研究では、ピペロニルブトキサイド（PBO）を長期間マウスに投与することで得られる持続性再生性病変の肝再生性結節を対象として、Nrf2 ホモ欠損マウスで観察されるシグナルと野生型で認められるシグナルとの差異がNrf2制御下シグナルの候補分子であると考え、そこにON/OFF制御因子ならびにNotchシグナル関連遺伝子群がどのように包含されているのかを解析する。
昨年度までの野生型マウスの肝再生性結節並びに肝腫瘍を用いた解析から、Notch4は肝腫瘍において発現が高い傾向が認められ、新鮮凍結切片を用いたin situハイブリダイゼーションの結果、その発現は主に血管内皮細胞様の細胞において認められることを見出した。本年度は、より詳細な観察を行うためホルマリン固定パラフィン包埋切片を用いてin situハイブリダイゼーションを試みた。しかしながら、解析条件によると考えられた解析の課題があったため、今後は免疫組織化学的解析を加えて各病変内のNotch関連分子の局在を検討する。Nrf2欠損下における持続性肝再生時のシグナル変化の検討についてはサンプル収集を継続した。今後これまでに収集したサンプルを用いて網羅的遺伝子発現解析を実施し、Nrf2欠損による影響を解析する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度までに、野生型マウスにPBOを投与して作成した肝再生性結節と肝腫瘍におけるNotch4の発現をRT-PCR法により検討した結果、Notch4発現は肝腫瘍で高い傾向が認められた。新鮮凍結切片を用いたin situハイブリダイゼーションの結果、Notch4は肝細胞以外の主に血管内皮細胞様の細胞に発現することを見出した。本年度は、Notch4発現細胞のより詳細な観察を行うために、形態観察に有用なホルマリン固定パラフィン包埋切片を用いてin situハイブリダイゼーションを試みた。しかしながら、ホルマリン固定時間などの解析条件が合わず、明瞭な陽性シグナルが観察できないなどの課題が残った。今後はin situハイブリダイゼーションの条件検討を継続すると共に、Notch4及び関連分子の免疫組織化学的解析を実施して、各病変内の局在を検討する予定である。
Nrf2欠損下における持続性肝再生時のシグナル変化の検討では、Nrf2 ホモ欠損マウスにPBOを投与した肝臓を用いて、PBO投与群の肝再生性結節と非結節部位及びPBO非投与群の肝臓をマイクロダイセクションにより切り出し、サンプルのRNA品質チェックを実施した。網羅的遺伝子発現解析を実施するための収量及び品質が確保されたサンプルを収集するのにやや時間を要したが、PBO非投与群のサンプルを除きサンプル収集はおおむね終了した。今後、これらサンプルを用いた網羅的遺伝子発現解析を実施する。加えて、野生型マウスの肝臓切片を用いて検討してきたin situハイブリダイゼーション又は免疫組織化学的解析を、Nrf2欠損マウスのサンプルについても実施する。進捗状況は、解決すべき課題がありやや遅れていると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、Notch4発現細胞の病変内局在をより詳細に観察するため、ホルマリン固定パラフィン包埋切片を用いてin situハイブリダイゼーションを試みたが、検討したサンプルでは明瞭な陽性シグナルが認められなかった。この結果はサンプルの固定条件の不具合による可能性が高いと考えられた。この課題に対応するため、今後はin situハイブリダイゼーションの反応条件を広く再検討すると共に、mRNAのみならずタンパク発現にも焦点を当てて解析を行う予定である。具体的にはNotch4及びNotchシグナル関連因子の免疫組織化学的解析を実施することで、各因子の病変内局在を検討する。
また、Nrf2欠損下における持続性肝再生時のシグナル変化の検討については、網羅的遺伝子発現解析を実施するためのNrf2 ホモ欠損マウスのサンプル収集を継続した。これまでに収集したサンプルを用いて網羅的遺伝子発現解析を実施し、野生型マウスにおける持続性再生シグナル変化と比較することで、Nrf2欠損による影響を解析する。加えて、Nrf2ホモ欠損マウスの肝再生性結節について、in situハイブリダイゼーションや免疫組織化学的解析を実施することにより、持続性再生シグナルにおけるNotchシグナル変動の生物学的意義とNrf2との関連を検討する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
試薬が予定価格より安価に購入できたため、次年度の試薬購入に充てたい。
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