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ヒストンの翻訳後修飾は、DNAのメチル化と並んで、エピジェネティック制御の中核をなす分子機構である。その制御メカニズムの動的側面を理解するためには、「どのタイミングで」「どの細胞において」「どの種類の修飾が」「ゲノム上のどの位置で」生じるのかを調べることが必要不可欠である。
しかし、現時点においてこれらすべての情報要素を同時に取り出すことのできる手法は存在しない。本研究は、CRISPR/Cas9システム、ヒストン修飾認識ドメイン、BiFCを組み合わせて利用することで、上記の情報要素すべてを同時に取り出すことのできるイメージング手法を開発することを目的とする。
昨年度に引き続き、特定遺伝子座におけるヒストン修飾の変化を可視化することを指向したBiFCの高度化を試みた。GFP結合タンパク質によるBiFCシグナルの増強効果は、GFPに由来する幅広い蛍光タンパク質に適用できることを確認した。GFP-GFP結合タンパク質の共結晶構造情報を解析し、GFP-GFP結合タンパク質間の相互作用に必要なGFP側のアミノ酸残基59残基を特定した。GFP由来の蛍光タンパク質ではこれら59残基の保存性が高いのに対して、GFPに由来しない蛍光タンパク質では、保存性が低いことが明らかになった。この結果と対応して、GFPに由来しない蛍光タンパク質の場合には、GFP結合タンパク質によるBiFCシグナル増強効果が見られなかった。
クロマチン上でのBiFC検出のモデルとして、近接した位置に標的配列を設定したdSpCas9-dSaCas9間のBiFCをGFP結合タンパク質によって増強することを試みた。GFP結合タンパク質を発現する細胞では、発現しない細胞に比べて、BiFCシグナルを検出できる割合が高くなることが確認された。この手法は、dCas9-ヒストン修飾結合タンパク質間のBiFC検出にも応用できる可能性がある。
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