| 研究課題/領域番号 |
18K06076
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
米沢 直人 千葉大学, 大学院理学研究院, 准教授 (80212314)
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| 研究分担者 |
柳田 光昭 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80365569)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 透明帯 / 受精 / 糖タンパク質 / Sf9細胞 |
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| 研究実績の概要 |
哺乳類卵子は透明帯(zona pellucida: ZP)と呼ばれる卵外被によって覆われている。ZPは受精時の精子－卵子間の種選択的認識，受精後の多精拒否，胚の保護などの役割を担う。ウシZPはZP2，ZP3，ZP4の3種類の糖タンパク質で構成されている。本研究ではZP3上のZP4相互作用部位同定を進めた。ZP3はZP-Nサブドメイン，ZP-N/ZP-Cリンカー領域，ZP-Cサブドメインからなるが，ZP-Nサブドメインおよびリンカー領域を含むArg32－Glu178(ZP3(32-178))とZP4とが複合体を形成し精子結合能を示すこと，更に，この複合体形成にはZP3のTrp156－Arg160が特に重要であることを以前報告している。平成30年度は，Trp156－Arg160の領域に以下の変異を導入した組換えタンパク質をSf9細胞で発現させ，ZP4との共沈量への各変異の影響を調べた。ZP3(32-178)のTrp156－Arg160について1残基ずつAlaに変異させたところ，共沈量の有意な低下は見られなかった。種間でよく保存されているTrp156，Pro158，Phe159の3残基をAlaに変異させたところ共沈量が有意に低下した。ZP3(32-160)をC末端Arg160から1残基ずつ欠失させたところ，Phe159までの欠失により共沈量が有意に低下した。また，ZP-Nサブドメインの必要性を調べるためマルトース結合タンパク質(MBP)融合ZP3(140-160)を作製した。MBP融合ZP3(140-160)がZP4と共沈したことから，ZP3のリンカー領域が単独でZP4と相互作用することが示唆された。以上の結果から，Trp156－Phe159の疎水性領域を中心とするZP3リンカー領域はZP4とのヘテロ複合体形成に関わると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ZP3とZP4との間の相互作用部位同定については順調に進んでいるが、他の項目については進捗がやや遅れている。ZP2フラグメントの高次構造解析についてはまだ良い結晶が得られていない。ZP3/ZP4複合体については，想定以上に分解しやすいことが判明し，また収量が低いことから高次構造解析用試料調製が遅れている。新たに開発した精子結合活性測定法の投稿論文について追加実験が終了せず，平成30年度内に再投稿できなかった。ウシ精子のZP4結合因子同定について3通りの方法を試みたが，特異的結合因子の同定には至らなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
新たに開発した精子結合活性測定法に関する追加実験を終了させ論文発表する。ZP2フラグメントの糖鎖付加部位変異体を作成し結晶化条件を検討する。ZP3/ZP4複合体のZP3フラグメントの領域を微調整することにより，収量の改善を図る。また，プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加し精製過程での分解を抑える。精子のZP4結合因子同定について，平成30年度に試みた3通りのビオチン標識法の特異性をそれぞれ確認し，研究分担者による質量分析へなるべく早く進める。
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