| 研究課題/領域番号 |
18K06078
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
沼本 修孝 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助教 (20378582)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | X線結晶構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、CD72-CTLDとSm/RNPの複合体の結晶構造を決定し、その構造情報に基づき特異的な分子認識機構を解明する。研究初年度の2018年度は、以下の通り研究を実施した。
1．CD72-CTLDの高純度試料調製方法の高効率化
CD72-CTLDの試料調製方法については、われわれのこれまでの研究から確立されていたものの、結晶化に必要な大量の試料を、一度に効率よく調製することは難しかった。CD72-CTLDは大腸菌発現系を用いて不溶性画分に大量発現させた後、on column refolding法により正しい立体構造に巻き戻してから精製する必要があり、このために使用するNiアフィニティークロマトグラフィー用レジンを数種類検討することで、これまでに使用していたレジンよりも高効率にrefoldが可能なレジンを見いだした。これにより、従来よりも大量の精製試料をより簡便かつ高効率に調製することが可能になった。
2．Sm/RNP試料の検討
Sm/RNP試料の調製に関して、比較対象として購入した市販のSm/RNP試料の純度、均一性などをSDS-PAGE、ゲル濾過クロマトグラフィー、および動的光散乱などで検討した結果、予想以上に高純度かつ均一性の高いものであることがわかった。これをさらに精製することにより、結晶化実験に使用可能な純度に達する可能性があり、ヒト培養細胞からの精製、または大腸菌発現系でのサブユニットことの発現と再構成などを想定した当初計画よりも簡便にSm/RNPの試料調製が行える見通しとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究で不可欠なCD72-CTLDとSm/RNPの複合体の結晶構造解析に向け、CD72-CTLD、およびSm/RNP試料を大量かつ高純度に得る方法の確立が初年度の計画であり、CD72-CTLDについては、われわれが確立していた調製法をさらに改良することができ、より高効率に試料調製を行うことができるようになった。Sm/RNPについても、結晶化を行うに当たり十分な純度、量を得ることに目処がつき、今年度以降の結晶化実験を円滑に行うことができる見通しが得られた。
以上のように、本研究は概ね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究二年目となる本年度は、当初計画通りCD72-CTLDとSm/RNPの複合体結晶調製を主に行う。前年度に確立した試料調製法により、効率よくCD72-CTLDおよびSm/RNPを調製し、結晶化実験を行う。複合体形成の確認をゲル濾過クロマトグラフィーやHisタグつきCD72-CTLDを利用したプルダウンアッセイなどにより確認しながら、安定的な複合体形成を実現する条件を確立させる。結晶化条件の検討は、市販のスクリーニングキットを使用して初期条件を探索し、有望な条件をさらに最適化する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
購入予定の物品が値引きにより想定より安価に購入できたためであり、物品費に充当して使用する。
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