| 研究課題/領域番号 |
18K06081
|
|---|
| 研究機関 | 山梨大学 |
|---|
研究代表者 |
大山 拓次 山梨大学, 大学院総合研究部, 准教授 (60423133)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | DNA複製 / CMGヘリカーゼ複合体 / Ｘ線結晶構造解析 |
|---|
| 研究実績の概要 |
DNA複製は生命の健全な維持にとって最も重要な細胞内イベントの一つであり、多数のタンパク質群が関与し、複雑ながらも精巧な仕組みによって執り行われる。DNA複製開始初期過程では、ORCによる複製開始点認識後、鋳型DNAを解きほぐす役割を果たすMCMヘリカーゼ(6量体)がリクルートされる。MCM単独では非常に低いヘリカーゼ活性しか有さないが、GINS(4量体)およびCdc45(古細菌ではGAN)という活性化因子を伴って総分子量約30万近いCMGヘリカーゼ複合体を形成することで必要な活性を持つようになる。本研究では真核生物と良く似たDNA複製機構を持つ古細菌に着目し、(1)真核生物と共有するCMGヘリカーゼ複合体と(2)現段階では古細菌固有と推定されるDNAポリメラーゼD(PolD)について、生化学解析により明らかとなった直接相互作用の機能的重要性を原子レベルで解明するため、2者複合体の高分解能結晶構造解析を目指す。今年度は相互作用解析により見出したCMG-PolD間の機能的部分複合体1について結晶構造解析実験を実施した。試験管内で再構成した複合体をカラムクロマトグラフィーによって、結晶化に適した純度にまで精製した。その間、精製過程での構成因子の著しい脱離は観測されず、この複合体が比較的安定であることが分かった。次に結晶化条件検索を行い、構造解析可能と見込まれる単結晶を取得した。シンクロトロン放射光を用いたＸ線回折実験を行い、3.0Å分解能のデータセットを数セット取得することに成功した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CMG-PolD機能的部分複合体1について、3.0Å分解能のＸ線回折データを取得しており、次年度早期には基本構造を決定し、CMGとPolD間の主要な相互作用様式を原子レベルで決定できると見込まれるため。
|
| 今後の研究の推進方策 |
CMG-PolD機能的部分複合体1について、まずは3.0Å分解能での基本構造決定を試みる。分子置換法による構造決定可能と見込んでいるが、構造が決定出来ない場合はセレノメチオニン置換体タンパク質を用いた解析を実施する。一方、今年度の本結晶のＸ回折実験にて、到達分解能2.8Åの回折点も観測しており、結晶調製条件の精密化により、3.0Åを上回る高分解能のデータセットの取得、およびより精密な複合体構造決定の可能性も有り、引き続き、部分複合体1の解析を継続する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
Ｘ線回折データ保存用のハードディスク等の購入を計画したが、本年度中に購入が必須の状況とはならなかったため、次年度に繰越し、ディスク容量や転送速度等、状況により適した物品を購入する方針に切り替えたため。研究進行には影響は全くない。
|
