| 研究課題/領域番号 |
18K06084
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
有吉 眞理子 大阪大学, 生命機能研究科, 特任助教(常勤) (80437243)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 染色体分配 / セントロメア / キネトコア / クライオ電顕 / 分子間相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
細胞分裂に伴う染色体分配は、遺伝情報の継承と生物の恒常性を担う極めて重要な過程である。染色体の均等分配は、染色体上のセントロメア領域に形成されるキネトコアと呼ばれる多数のタンパク質からなる超分子構造体によって制御されている。細胞分裂期において、姉妹染色体は紡錘体微小管にとらえられて、分離され、娘細胞へと運ばれる。セントロメア上に形成されたキネトコアは、細胞分裂の際に染色体と紡錘体微小管を連結する役割を果たす。キネトコアにはCENP-C/Mis12複合体もしくはCENP-Tタンパク質を介した2つの染色体-紡錘体微小管連結経路が存在する。本研究では、今回、キネトコア分子構造体の可塑性と頑強性を支える仕組みを解明するため、生化学と構造生物学の手法を用いて、キネトコアにおける染色体と紡錘体微小管の連結の要となるCENP-Cタンパク質の機能解析を行なった。
セントロメア はヒストンH3のバリアントであるCENP-Aはセントロメア によって規定される。CENP-CはこのCENP-Aを取り込んだヌクレオソームを認識し、セントロメア 上でのキネトコア形成の核となる。これまでに、細胞周期依存的なCENP-Cのリン酸化が機能的なキネトコア形成に重要であることが明らかにされているが、その詳細な分子機構は未だ不明である。今回、クライオ電顕による単粒子解析を用いて、リン酸化CENP-CとCENP-A ヌクレオソームの複合体の立体構造を決定した。生化学的な解析およびニワトリのDT40細胞を用いた機能解析の結果と合わせて、細胞周期依存的なリン酸化によるCENP-C/CENP-Aヌクレオソーム相互作用の安定化の構造基盤を明らかにした。得られた結果に基づいて、CENP-Cのリン酸化を介したキネトコアにおけるタンパク質会合状態の制御の新規モデルを提唱した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
細胞分裂期特異的なCDK-1によるin vitroリン酸化によってリン酸化CENP-Cを調製し、CENP-Aヌクレオソームとの複合体のクライオ電顕観察のためのサンプルを調製、構造決定に成功した。さらに、生化学的な実験、変異体解析を行い、新規の機能モデルを提唱するに至っている。これらの実験結果は、学術論文として成果発表をするための投稿準備を行っており、概ね研究は順調に進んでいると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究では以下の3つの研究項目に関して、タンパク質化学・構造生物学の観点から解析を行う。
① CENP-C経路におけるとCENP-Cとキネトコアタンパク質の構造機能相関. 今回明らかにしたCENP-C/CNEP-Aヌクレオソーム複合体の構造から、もう一つのCNEP-Aヌクレオソーム結合タンパク質であるCENP-Nとの細胞周期依存的な排他的な結合モードが示唆された。キネトコア分子構造体の可塑性と頑強性を支える仕組みの解明の一環として、このCENP-CとCENP-NのCENP-Aヌクレオソーム結合モードの切り替えのメカニズムについて、生化学的な手法を用いてさらに詳細な分子機構を検証する。
② CENP-Cの自己会合の役割. 前年度における本研究の結果から、CENP-CがC-末端領域の保存されたCupinドメインを介して自己会合することがわかっている。この自己会合が機能的なキネトコア形成に重要であることが示唆されており、今後、この自己会合の染色体分配における機能的な役割を明らかにするために変異体解析を引き続き行う。
③ CENP-T経路およびCENP-C経路におけるとNdc80複合体との結合制御. キネトコアにはCENP-C/Mis12複合体もしくはCENP-Tタンパク質を介した 2つの染色体-紡錘体微小管連結経路が存在する。これまでに細胞分裂期特異的なリン酸化によって、CENP-TおよびCENP-C/Mis12複合体のNdc80複合体への結合が排他的に制御されることを明らかにしている。今後、制御機構の構造基盤の解明に向け、まだ構造知見がないCENP-C/Mis12複合体とNdc80の複合体の結晶化、結晶構造解析を行う。現在までに、複合体の結晶を得ており、今後この結晶化条件の改善、結晶構造解析を進めていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
該当年度の後半は、クライオ電顕を用いた構造解析、およびその成果発表のための論文投稿準備を行なったため、予定していた生化学的な解析、結晶化実験のための試薬購入が予定していたよりも少なかった。それについては、今後のタンパク質複合体の結晶化のための試薬、精製のためのカラム購入、相互作用解析のための消耗品の購入に使用する。
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