| 研究課題/領域番号 |
18K06104
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
岸本 拓磨 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 助教 (70585158)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | リン脂質膜非対称性 / フリッパーゼ / ステロール / 脂質輸送タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
真核生物全般に保存される細胞膜におけるリン脂質非対称性は重要な生理的意義を持つと予想されるが、その意義は完全に明らかにはなっていない。本研究では出芽酵母解析系により細胞膜リン脂質非対称性に関わる遺伝子変異株crf1 lem3 sfk1が示す非対称性の崩壊と致死性を指標に、その原因を探求することでリン脂質非対称性の生理的意義の解明を目的としている。本年度は以下の研究を中心に進めた。
遺伝学的スクリーニング：多コピープラスミドに酵母ゲノム断片を含むゲノムライブラリーを用いて、三重変異株に形質転換することにより致死性が抑圧する遺伝子を探索する遺伝学的スクリーニングを行った。三重変異株の致死性を高発現によって抑圧する遺伝子群の中には、致死性の原因に関与する遺伝子の存在が推測される。このスクリーニングから、脂質輸送タンパク質群に含まれるオキシステロール結合タンパク質Kes1の多コピープラスミドにより三重変異株が示す致死性が抑圧されることを確認した。この致死性の抑圧効果は、Kes1に含まれるステロール結合能に依存しており、三重変異株の致死性がステロールに起因している可能性が示唆された。
脂質レベルの変化：三重変異株において脂質非対称性が崩壊することで、脂質レベルでどのような変化が生じているのかについて解析を行った。本年度は、昨年度に引き続き、生化学的な解析を行ったところ、三重変異株ではリン脂質の量には大きな変化が生じず、ステロール類の顕著な低下が生じていることを明らかにした。また、蛍光ステロールを酵母菌体に取り込ませて、動態の追跡を行なった。その結果、細胞膜自体でステロールを保持できなくなり、余剰ステロールが脂肪滴に輸送され、増加に至っている可能性を見出した。
以上の結果から、リン脂質非対称性は、細胞膜のステロールレベルを制御する事で細胞膜インテグリティに寄与しうる事が示唆されている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、三重変異株が示す細胞膜リン脂質非対称性の異常が引き起こす細胞膜インテグリティの異常、細胞内小器官の異常、脂質分布の異常が引き起こされる原因について解析を行った。予定していた研究計画の「関連遺伝子のスクリーニング」について、種々の現象における原因究明に直結する結果が得られた。この遺伝子の機能を中心に分子生物学的アプローチ、遺伝学的アプローチを行い、脂質分布や量的変化に焦点を当て解析を進めた。研究としては大きな進展が見られ、今後の方向性に大きな変更がなく進むことができるため、おおむね順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
リン脂質膜非対称性が異常になることが細胞膜現象に大きな影響を及ぼしていることから、細胞膜自体の性質に焦点を当て解析を行う。細胞膜の物性に関する解析：細胞膜の透過性と脂質充填密度・流動性について三重変異株でどのように変化するかを測定する。
細胞膜を構成する脂質に関する解析：三重変異株で三重変異株において脂質非対称性が崩壊することで、脂質レベルでどのような変化が生じているのかについて詳細に解析する。三重変異株で生じたステロール類の顕著な低下について、その原因オルガネラを探求する。オルガネラのどの部分に異常が生じているかを明らかにするために、ステロールの分布を可視化する脂質特異的プローブを開発した。次年度は、細胞膜の脂質分布がどのように変化しているのかについてプローブ用いた顕微鏡観察を中心に解析を進める。
細胞膜脂質非対称性制御に関わる遺伝子のスクリーニングの継続：多コピープラスミドによる遺伝学的スクリーニングにより、心にせまる候補遺伝子を得ることに成功した。この遺伝子の解析を中心に、申請研究は精力的に展開している一方、さらなる関連遺伝子の存在も期待され、スクリーニングを継続する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度は、計画当初より物品費が少なかったため、683,481円を次年度に使用する。
次年度は、合成DNA、生化学用試薬類、使い捨てプラスチック器具の購入のための物品費として1,003,481円を、論文投稿に関わる費用（印刷費や英文校正かかる費用）480,000円を、塩基配列解析にかかる費用として100,000円を使用する予定である。
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