今までにない高時間レベルでイオンポンプ型ロドプシンのイオン輸送を測る

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K06109
• 研究機関: 名古屋工業大学
• 研究代表者: 角田 聡 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 研究員 (00598857)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: イオンポンプ / ロドプシン / 電気生理学 / イオン輸送 / オプトジェネテイクス / 光遺伝学

研究実績の概要

光駆動型イオンポンプであるロドプシン分子によるイオン輸送を、今までにないマイクロ秒オーダーの時間分解で測定する。バクテリオロドプシンなどのポンプ型ロドプシンは、光受容に伴う光反応サイクルにおいてイオンを能動輸送するが、その反応サイクルは数十ミリ秒程度である。過去のイオンポンプ活性測定では時間分解能がサブ秒～分オーダーであり、かつ膜電位、イオン濃度勾配などの電気化学ポテンシャル差の正確な制御が困難であった。本研究では電気生理学的手法にナノ秒フラッシュレーザーを組み合わせる。これにより、電気化学ポテンシャル差を正確に制御しながら、ロドプシンの光反応を１回のみ誘起した際のイオン輸送を測定し、輸送速度、輸送量を定量的に解析することで、光反応サイクルにおけるエネルギー変換メカニズムの理解に迫る。
昨年度までにプロトンポンプロドプシン、及びナトリウムポンプロドプシン分子のシングルターンオーバーあたりの輸送測定を、電気化学ポテンシャル差が存在する状態（膜電位がかかった状態）で行い、イオンポンプとしてのポンプの駆動力を算出した。
ところで、アスガルド古細菌類のゲノム解析から、ロドプシン様遺伝子（SzR)の存在が明らかになった。当該年度は、これらアスガルド古細菌類から発見された、SzRのイオン輸送能を評価した。その結果この分子は、今まで知られていたプロトンポンプとは逆方向にイオン輸送を行う（つまり細胞外から細胞内へプロトン輸送を行う）光駆動型逆向きプロトンポンプ（内向きプロトンポンプ）ロドプシンであることが判明したさらに、現在知られている7種のSzR分子すべてのイオン輸送活性測定から、ポンプ活性の速度論的解析、波長依存性、pH依存性等の基礎的物性を評価した。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

当初の計画では、既存のプロトンポンプロドプシン、及びナトリウムポンプロドプシン分子のポンプとしての駆動力の測定、およびその分子メカニズムに関する実験を立案した。これらの研究はおおむね終了することができた。
更に昨年度からは、上記のポンプ分子に加えて新規光駆動型逆向きプロトンポンプ（内向きプロトンポンプ）ロドプシン（SzR）のイオン輸送活性測定を開始しており、今後はSzRの詳細なイオン輸送機構の解明のための研究を進める予定である。

今後の研究の推進方策

SzRによる内向きプロトン輸送を、今までにないマイクロ秒オーダーの時間分解で測定する。現在までに進めてきたSzRの電気生理学的手法によるプロトンポンプ活性測定を、今後はナノ秒フラッシュレーザーを光源として用いることで、シングルターンオーバーあたりのイオン輸送計測を行う。具体的にはSzR分子をND7/23やHEK293細胞へ発現させ、ホールセルパッチクランプ測定を行う。パッチクランプ法においては細胞膜電位を任意の値に固定することができるため、一定の膜電位下でのイオン輸送計測が可能である。つまり電気化学ポテンシャル差に対抗したイオン輸送を測定することで、イオンポンプの駆動力の計測が可能となる。さらに細胞内外のｐH等の溶液条件も任意に操作できるので、ｐH勾配下でのイオン輸送能も評価する。

研究成果

• [雑誌論文] Schizorhodopsins: A novel family of rhodopsins from Asgard archaea that function as light-driven inward H+ pumps (2020)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue, Satoshi P. Tsunoda, Manish Singh, Sahoko Tomida, Shoko Hososhima, Masae Konno, Ryoko Nakamura, Hiroki Watanabe, Paul-Adrian Bulzu, Horia L. Banciu, Adrian Andrei, Takayuki Uchihashi, Rohit Ghai, Oded Beja, Hideki Kandori
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 6 ページ: eaaz2441
  • DOI: 10.1126/sciadv.aaz2441
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Molecular properties of new enzyme rhodopsins with PDE activity (2020)
  • 著者名/発表者名: Sugiura M., Tsunoda SP., Hibi M., Kandori H
  • 雑誌名: ACS Omega 巻: 5 ページ: 10602-10609
  • DOI: 10.1021/acsomega.0c01113
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Crystal structure of heliorhodopsin (2019)
  • 著者名/発表者名: W. Shihoya, K. Inoue, M. Singh, M. Konno, S. Hososhima, K. Yamashita, K. Ikeda, A. Higuchi, T. Izume, Okazaki S, Hashimoto M, Mizutori R, Tomida S, Yamauchi Y, Abe-Yoshizumi R, K. Katayama, SP. Tsunoda, M. Shibata, Y. Furutani, A. Pushkarev, O. Béjà, T. Uchihashi, H. Kandori, O. Nureki
  • 雑誌名: Nature 巻: 574 ページ: 132-136
  • DOI: 10.1038/s41586-019-1604-6
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Ion Channel Properties of a Cation Channelrhodopsin (2019)
  • 著者名/発表者名: S. Shigemura, S. Hososhima, H. Kandori, SP. Tsunoda
  • 雑誌名: Appl. Sci. 巻: 9 ページ: 3440
  • DOI: 10.3390/app9173440
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Electrophysiological study and Optogenetics application of inward-directed proton-pumping rhodopsin, NsXeR (2019)
  • 著者名/発表者名: 角田聡、細島頌子、神取秀樹
  • 学会等名: 日本生物物理学会第56回年会
  • 国際学会
• [学会発表] 酵素型ロドプシンの分子機構と光遺伝学への応用 (2019)
  • 著者名/発表者名: 角田聡
  • 学会等名: 物性研ワークショップ「レチナールタンパク質の光機能発現の物理と科学」
  • 招待講演
• [学会発表] 「酵素型ロドプシン：細胞内シグナル伝達を光で操る」 (2019)
  • 著者名/発表者名: 角田聡
  • 学会等名: 第42回日本分子生物学会年会
  • 国際学会 / 招待講演