| 研究実績の概要 |
本年度では、これまでに確立した精製手法をEDEM1およびEDEM3の酵素活性解析に適用し、以下の成果を得た。(1) 免疫沈降法と非還元条件でのウエスタンブロット解析により、TXNDC11とEDEM1あるいはEDEM3が分子間ジスルフィド結合を形成するか調べた。その結果、EDEM2とは異なり、EDEM1およびEDEM3はいずれもTXNDC11とは分子間ジスルフィド結合を形成しないことを見出した。(2)TAP(プロテインA-TEV認識配列)タグを付加したEDEM1、あるいはEDEM3を単独でHCT116細胞に発現させ、IgGビーズとTEVプロテアーゼ切断により精製し、高純度のリコンビナントEDEM1およびEDEM3を得た。(３)合成M8B糖鎖を基質としたin vitro解析を実施し、精製したEDEM1およびEDEM3の酵素活性の検証を行なった。その結果、精製EDEM3によりM8B糖鎖のマンノースがトリミングされ、M8B型からM7,M6,M5型に変換された。精製EDEM1についても同様の結果が得られたが、EDEM1およびEDEM3の遺伝子破壊解析の結果と一致して、EDEM3の方がより高い活性を示した。一方、精製EDEM2-TXNDC11複合体については、M8B糖鎖からM7糖鎖への変換がわずかに観察されたのみであった。これらの結果と前年度までの結果を合わせて、小胞体におけるマンノシダーゼトリミングの第1段階(M9糖鎖からM8B糖鎖への変換)はEDEM2が担い、第2段階(M8B糖鎖からM7,M6,M5糖鎖への変換)はEDEM3およびEDEM1が担うことが生化学的に示された。
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