| 研究課題/領域番号 |
18K06112
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
山本 泰憲 神戸大学, 医学研究科, 准教授 (30467659)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 小胞体 / オートファジー / ER-phagy / 膜変形タンパク質 / Three-way junction |
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| 研究実績の概要 |
小胞体の恒常性は選択的オートファジー（ER-phagy）により維持されており、小胞体の不要になった領域が膜変形、膜分裂し、隔離膜に包まれて排除される。本研究では、ER-phagyにおける小胞体の局所の膜変形と膜分裂の分子メカニズムを明らかにし、膜変形タンパク質のプロテオスタシスの立場から小胞体の恒常性維持機構を解明することを目的とする。チューブ状小胞体を連結する三つ又構造（three-way junction）がER-phagyの調節に重要な働きをしていることが知られている。昨年度、私どもはthree-way junction形成を制御する新しい小胞体膜タンパク質TMCC3を発見した。本年度はTMCC3の性状解析を更に推し進め、以下の知見を得た。
Three-way junctionは膜融合タンパク質atlastinと膜安定化タンパク質lunaparkにより形成される。そこで、これらのタンパク質とTMCC3の機能関係を解析したところ、TMCC3 siRMAノックダウンによるthree-way junction数の減少はatlastinの過剰発現によりレスキューされる一方、lunaparkの過剰発現ではレスキューされなかった。これらのことから、TMCC3はatlastinの上流で機能し、atlastinの活性を正に調節することでthree-way junction形成を制御していることが明らかになった。TMCC3を細胞内に過剰発現すると凝集体を形成した。Three-way junctionへの局在に必要な領域を欠失させると凝集体が消失した。これらのことから、TMCC3の活性は凝集体形成により調節されていると考えられた。このように本年度は、ER-phagyに重要なthree-way junctionの制御機構について新しい知見が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、TMCC3がatlastinの上流分子として機能することで、three-way junctionの形成を制御していることを明らかにした。他方、TMCC3のsiRNAノックダウンはthree-way junctionの数を減少するのみならず、小胞体の膜曲率を不安定化した。このような膜曲率の不安定化はatlastinのsiRNAノックダウンでは生じないことから、TMCC3は未知のメカニズムにより膜融合と膜曲率の安定化を密接に連携させていると考えられた。
また、TMCC3が凝集体を形成する活性を有していること明らかにし、凝集体形成がTMCC3の活性と密接に関わっている可能性を示唆した。最近、タンパク質の液－液相分離現象がタンパク質の活性調節の新しいメカニズムとして明らかになってきている。TMCC3の凝集体が液－液相分離を示している可能性があり、TMCC3が液－液相分離を介してthree-way junction形成ひいてはER-phagyを制御している可能性が考えられた。
このように小胞体の恒常性維持機構に関わる新しい知見が得られたことから、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
膜変形タンパク質とRFPの融合タンパク質およびGFP-LC3の両方を安定に発現する細胞株を樹立し、蛍光顕微鏡で膜変形タンパク質がオートファゴソームへ取り込まれる過程をliveで検出する。膜変形タンパク質の様々な変異体を作成し、オートファゴソームへの取り込みに必要なドメインを決定する。このドメインに結合するタンパク質を網羅的に精製、同定し、膜変形タンパク質をER-phagy小胞へ選択的に取り込む分子メカニズムを明らかにする。
同定したER-phagy小胞を形成するタンパク質、ER-phagy受容体、膜変形タンパク質、膜安定化タンパク質の全長の組換えタンパク質を作製し、人工脂質膜に組み込んでプロテオリポソームを作製する。各タンパク質の組み合わせや構成比率、加える順序やタイミング、プロテオリポソームの脂質組成（膜の剛直性）やサイズ（膜の曲率）と形状（脂質の充填状態）、プロテオリポソームの支持担体への固定（膜の張力）を様々に変化させて生体内では不安定で解析不可能な膜変形から膜分裂に至る各遷移状態を人工膜上で再現し、その分子実体を脂質膜構造を含めて明らかにする。得られた知見を統合し、隔離膜に共役して生じる小胞体膜リモデリングの全過程をタンパク質と脂質の両方のレベルで世界に先駆けて解明する。
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